肿瘤特异性启动子及其应用制造技术

本发明专利技术属于肿瘤免疫治疗领域，具体涉及肿瘤特异性启动子及其应用。本发明专利技术所要解决的技术问题是溶瘤腺病毒肿瘤特异性增殖能力有限。本发明专利技术解决上述问题的方案是提供一种核心启动元件，既有独立的启动基因表达的功能，又可单独作为启动子使用，也可作为元件构建启动子。其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；或者在序列SEQ ID No.1所示的核苷酸序列中有1个或几个碱基插入、缺失和/或替换突变，且仍具有启动子功能的核酸分子。本发明专利技术修饰的肿瘤特异性启动子，具有更好的肿瘤特异性启动子功能，以此启动子构建的溶瘤腺病毒具有能够在肿瘤细胞中特异增殖，而不在正常细胞中增殖特点，是一种优秀的针对多种肿瘤的免疫治疗药物。种优秀的针对多种肿瘤的免疫治疗药物。种优秀的针对多种肿瘤的免疫治疗药物。

【技术实现步骤摘要】
肿瘤特异性启动子及其应用


[0001]本专利技术属于肿瘤免疫治疗领域，具体涉及肿瘤特异性启动子及其应用。

技术介绍

[0002]手术治疗、放射治疗和化学治疗等是目前治疗肿瘤的常规手段。近年来,肿瘤免疫治疗发展迅速，已成为肿瘤临床治疗研究的热点。溶瘤腺病毒是重组的复制型腺病毒，通过插入肿瘤特异性启动子或缺失病毒在正常细胞中增殖所需相关基因，仅在肿瘤细胞中增殖的病毒，能够特异性杀伤肿瘤细胞而对正常细胞无杀伤活性。溶瘤腺病毒是具备易于生产、高效临床安全等优良特性。近年来,溶瘤腺病毒因其创新性和疗效成为肿瘤治疗领域的热点。
[0003]尽管溶瘤腺病毒在肿瘤治疗中取得了一定进展，但在大部分临床实验中未能展现完全的抗肿瘤作用，其主要面临几个方面的挑战，包括溶瘤腺病毒肿瘤特异性增殖能力有限，在瘤内感染传播受限，单一治疗无法应对肿瘤复杂性，肿瘤抑制微环境抑制溶瘤腺病毒作用等。针对溶瘤腺病毒应用的挑战，主要解决措施有优化肿瘤特异性启动子增强瘤内增殖能力、表达促凋亡蛋白使肿瘤细胞敏感化、优化运输方式及介导免疫调节等。
[0004]肿瘤特异性高效增殖能力是溶瘤腺病毒的源头创新环节，也是临床应用最大挑战之一。为保证溶瘤腺病毒在正常细胞中的安全性，确保其仅在肿瘤细胞中增殖，主要通过两种方式进行：一是利用肿瘤特异性启动子控制病毒增殖所必需的基因，从而控制病毒的增殖；二是将病毒增殖在正常细胞中所必需而在肿瘤细胞中不需要的基因进行缺失，使病毒只能在肿瘤细胞中增殖，前者的应用已成为靶向基因病毒治疗中的一个重要策略。
[0005]人端粒酶逆转录酶(Human telomerase reverse transcriptase,hTERT)被证实与正常组织相比，在多种恶性肿瘤组织中高表达，如肺癌、食管癌、乳腺癌、甲状腺癌、黑色素瘤、宫颈癌、直肠癌、肾癌及白血病细胞等多种恶性肿瘤。因而端粒酶的启动子可被作为肿瘤特异性启动子用于溶瘤腺病毒治疗，现有研究表明hTERT启动子作为肿瘤特异性启动子活性相当有限，实际应用中难以取得好的效果。
[0006]本领域目前急需对肿瘤特异性启动子进行优化改构，提高溶瘤腺病毒的肿瘤特异性高效增殖能力，进而实现溶瘤腺病毒的高效特异性杀伤能力，为本领域肿瘤免疫治疗的研发提供新的有效选择。

技术实现思路

[0007]本专利技术所要解决的技术问题是溶瘤腺病毒肿瘤特异性增殖能力有限。本专利技术解决上述问题的技术方案是提供了一种核心启动元件。该核心启动元件既有独立的启动基因表达的功能，可单独作为启动子使用，也可作为元件构建启动子。
[0008]该核心启动元件：
[0009]1)、核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；
[0010]或者：
[0011]2)、在序列SEQ ID No.1所示的核苷酸序列中有1个或几个发生碱基插入、缺失和/或替换突变，且仍然具有启动子功能的核酸分子。
[0012]优选的，上述的1个或几个碱基插入、缺失和/或替换突变为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个碱基发生插入、缺失和/或替换突变。
[0013]进一步的，上述的核心启动元件的核苷酸序列如SEQ ID No.3、SEQ ID No.4或SEQ ID No.5中的任一项所示。
[0014]本专利技术还同时提供了含有上述的核心启动元件的启动子。
[0015]进一步的，上述的启动子的核苷酸序列如SEQ ID No.6、SEQ ID No.7或SEQ ID No.8所示。
[0016]其中，上述的启动子还插入了至少一个E2F结合位点。
[0017]其中，上述的E2F结合位点的核苷酸序列如SEQ ID No.15所示。或者是在序列SEQ ID No.15所示的核苷酸序列中有1个或几个碱基插入、缺失和/或替换突变，且仍然具有E2F结合位点功能的核酸分子。
[0018]优选的，上述的1个或几个碱基插入、缺失和/或替换突变为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个碱基发生插入、缺失和/或替换突变。
[0019]进一步的，上述的启动子中的E2F结合位点插入在上述核心启动元件的5
’
端和/或3
’
端。
[0020]进一步的，上述的启动子的核苷酸序列如SEQ ID No.9、SEQ ID No.10、SEQ ID No.11、SEQ ID No.12、SEQ ID No.13或SEQ ID No.14所示。
[0021]本专利技术也提供了上述的核心启动元件或者上述启动子在制备病毒或质粒中的应用。进一步的，所述的病毒为腺病毒。更进一步的，所述的腺病毒为溶瘤腺病毒。
[0022]本专利技术也提供了含有上述核心启动元件或者上述启动子的重组载体。
[0023]其中，上述的重组载体是质粒载体或病毒载体。
[0024]其中，上述的的病毒载体是腺病毒载体、腺病毒相关病毒或逆转录病毒载体。
[0025]其中，上述的病毒载体是溶瘤病毒。
[0026]进一步的，上述溶瘤病毒是溶瘤腺病毒、溶瘤细小病毒、溶瘤疱疹病毒、溶瘤痘病毒、溶瘤水泡性口炎病毒、溶瘤麻疹病毒、溶瘤粘液瘤病毒、溶瘤逆转录病毒、溶瘤呼肠孤病毒、溶瘤痘苗病毒中的至少一种。
[0027]其中，上述的质粒载体为pDC316、pDC311、pDC312、pDC315、pDC511、pDC512、pDC515、pDC516、pShuttle、pShuttle
‑
CMV、pCTAP
‑
Shuttle系列质粒、pNTAP
‑
Shuttle系列质粒、pAdTrack、pAdTrack
‑
CMV、pacAd5系列质粒、pHBAd系列质粒或者pXC1质粒中的至少一种。
[0028]其中，上述重组载体中所述的溶瘤腺病毒是血清型属于A亚属、B亚属、C亚属、D亚属、E亚属、F亚属或、G亚属的腺病毒。
[0029]其中，上述重组载体中所述的溶瘤腺病毒可选自血清型中分属A亚属的12、18、31和61型，分属B亚属的3、7、11、14、16、21、34、35、55、66、68、76～79型，分属C亚属的1、2、5、6、57和89型；分属D亚属的8、9、13、15、17、19、20、22～30、32、33、36～39、46、48、49、53、54、56、58～60、62～65、67、69～75、80～88、90～103型；分属E亚属的4型，分属F亚属的40和41型；分属G亚属52型等腺病毒。
[0030]其中，上述的重组载体中所述的溶瘤腺病毒中是由上述的核心启动元件或者上述启动子驱动E1A和/或E1B
‑
19K基因的表达。
[0031]其中，上述重组溶瘤腺病毒中所述的E1A为缺失了中间的24bp的E1A(Delta24)，核苷酸序列为SEQ ID No.16所示。其中，所述的E1B 19K的核苷酸序列为SEQ ID No.17所示。
[0032]本专利技术同本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.核心启动元件，其特征在于：1)、核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；或者：2)、在序列SEQ ID No.1所示的核苷酸序列中有1个或几个碱基插入、缺失和/或替换突变，且仍然具有启动子功能的核酸分子。2.根据权利要求1所述的核心启动元件，其特征在于，核苷酸序列如SEQ ID No.3、SEQ ID No.4或SEQ ID No.5中的任一项所示。3.含有权利要求1或2所示的核心启动元件的启动子。4.根据权利要求3所述的启动子，其特征在于：核苷酸序列如SEQ ID No.6、SEQ ID No.7或SEQ ID No.8所示。5.根据权利要求3或4所述的启动子，其特征在于：还插入了至少一个E2F结合位点。6.根据权利要求5所述的启动子，其特征在于：所述的E2F结合位点的核苷酸序列如SEQ ID No.15所示；或者，所述的E2F结合位点为在序列SEQ ID No.15所示的核苷酸序列中有1个或几个碱基插入、缺失和/或替换突变，且仍然具有E2F结合位点功能的核酸分子。7.根据权利要求4～6任一项所述的启动子，其特征在于：所述的E2F结合位点插入在权利要求1或2所述的核心启动元件的5
’
端和/或3
’
端。8.根据权利要求7所述的启动子，其特征在于：核苷酸序列如SEQ ID No.9、SEQ ID No.10、SEQ ID No.11、SEQ ID No.12、SEQ ID No.13或SEQ ID No.14所示。9.权利要求1或2所述的核心启动元件或者权利要求3～8任一项所述的启动子在制备溶瘤病毒或质粒中的用途。10.根据权利要求9所述的用途，其特征在于所述的溶瘤病毒是溶瘤腺病毒。11.含有权利要求1或2所述的核心启动元件或者权利要求3～8任一项所述的启动子的重组载体。12.根据权利要求11所述的重组载体，其特征在于所述的重组载体是质粒载体或病毒载体。13.根据权利要求12所述的重组载体，其特征在于所述的病毒载体是腺病毒载体、腺病毒相关病毒或逆转录病毒。14.根据权利要求12所述的重组载体，其特征在于所述的病毒载体是溶瘤病毒。15.根据权利要求14所述的重组载体，其特征在于所述的溶瘤病毒是溶瘤腺病毒、溶瘤细小病毒、溶瘤疱疹病毒、溶瘤痘病毒、溶瘤水泡性口炎病毒、溶瘤麻疹病毒、溶瘤粘液瘤病毒、溶瘤逆转录病毒、溶瘤呼肠孤病毒、溶瘤痘苗病毒中的至少一种。16.根据权利要求15所述的重组载体，其特征在于所述的溶瘤腺病毒是血清型属于A亚属、B亚属、C亚属、D亚属、E亚属、F亚属或、G亚属的腺病毒；进一步的，所述的腺病毒为：选自A亚属的12、18、31或61型中的至少一种；或者，选自B亚属的3、7、11、14、16、21、34、35、55、66、68、76、77、78或79型中的至少一种，或者，选自C亚属的1、2、5、6、57或89型中的至少一种；或者，选自D亚属的8、9、13、15、17、19、20、22～30、32、33、36～39、46、48、49、53、54、56、...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨莉，田要美，
申请(专利权)人：四川大学，
类型：发明
国别省市：