一种同时测定CAH六种相关类固醇激素的方法技术

本发明专利技术涉及先天性肾上腺皮质增生症筛查领域，具体涉及一种同时测定CAH六种相关类固醇激素的方法。所述六种相关类固醇激素为17α

【技术实现步骤摘要】
一种同时测定CAH六种相关类固醇激素的方法


[0001]本专利技术涉及先天性肾上腺皮质增生症筛查领域，具体涉及一种同时测定CAH六种相关类固醇激素的方法。

技术介绍

[0002]先天性肾上腺皮质增生症(CAH)，是较常见的常染色体隐性遗传病，由于皮质激素合成过程中所需酶的先天缺陷所致。皮质醇合成不足，使血中浓度降低，由于负反馈作用，刺激垂体分泌促肾上腺皮质激素增多，导致肾上腺皮质增生并分泌过多的皮质醇前身物质，如11
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去氧皮质醇和肾上腺雄酮等，从而发生一系列的临床症状。临床症状主要表现为：1、失盐型，为临床表现最重的一型，可表现出严重的低钠血症、嗜睡、呕吐和体重增加缓慢等情况；2、单纯的男性化，除没有严重的失盐表现外，其他雄性激素过高表现大多都会存在；3、非经典型，也就是女性患者在出生时，外生殖器正常或轻度的阴蒂肥大，没有外生殖器两性畸形。最常见的症状可能会表现为儿童的阴毛提早出现，或年轻女性中表现为严重的囊性痤疮、多毛症、多囊卵巢、月经稀发，甚至闭经。CAH根据酶类型的缺乏分为6型，分别为21
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羟化酶缺陷(21
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OHD)、11β
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羟化酶缺陷(11
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OHD)、17
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羟化酶缺陷、3β羟脱氢酶缺陷、皮质酮甲基氧化酶缺陷及先天性类脂质性肾上腺增生，其中最常见的是21
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羟化酶缺乏症，占90％～95％，其次为11
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羟化酶缺乏症，占5％～8％，其它类型的较少见。
[0003]由于失盐型CAH患儿常有危及生命的低钠血症、高钾血症、血容量降低及休克发生，因此即使诊断筛查尤为重要。经典的21
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羟化酶缺乏的病人血清17α
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羟孕酮水平显著增高，因此国内CAH新生儿筛查技术主要是时间分辨荧光分析法和酶联免疫法测定干滤纸片中17α
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羟孕酮浓度。但是该技术由于存在交叉反应，特异性低，导致假阳性率高，阳性预测值低。而且无法有效检测出占CAH中发病率相对较高的11β
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羟化酶缺陷。
[0004]因此，提供一种更有效的CAH筛查方法，提高筛查的特异性和阳性预测值具有重要的意义。

技术实现思路

[0005]有鉴于此，有必要针对上述的问题，提供一种同时测定CAH六种相关类固醇激素的方法，提高CAH筛查的特异性和阳性预测值。
[0006]为实现上述目的，本专利技术采取以下的技术方案：
[0007]一种同时测定CAH六种相关类固醇激素的方法，所述六种相关类固醇激素为17α
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羟孕酮、雄烯二酮、11
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脱氧皮质醇、21
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脱氧皮质醇、皮质醇和皮质酮；包括以下步骤：
[0008]步骤S1：分别制备混合内标准品、质控品和标准曲线制品：所述混合内标准品为17α
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羟孕酮同位素内标准品、雄烯二酮同位素内标准品、11
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脱氧皮质醇同位素内标准品、21
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脱氧皮质醇同位素内标准品、皮质醇同位素内标准品和皮质酮同位素内标准品的混合物；所述质控品为含有已知浓度的17α
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羟孕酮、雄烯二酮、11
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脱氧皮质醇、21
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脱氧皮质醇、皮质醇和皮质酮六种类固醇激素的人全血滤纸干血片；所述标准曲线制品为含有已知系列浓
度的17α
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羟孕酮、雄烯二酮、11
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脱氧皮质醇、21
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脱氧皮质醇、皮质醇和皮质酮六种类固醇激素的人全血滤纸干血片；
[0009]步骤S2：制备样本提取液：在混合内标准品中加入有机溶剂，溶解后稀释；
[0010]步骤S3：提取和孵育样本：用样本提取液分别提取标准曲线制品以及待测样本，然后进行孵育；
[0011]步骤S4：浓缩复溶样本：分别对孵育后的上清液进行浓缩后，并加入50％甲醇复溶，得到复溶液；
[0012]步骤S5：测试：用液相色谱串联质谱仪对复溶液进行测定，绘制校准曲线，计算待测样本中17α
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羟孕酮、雄烯二酮、11
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脱氧皮质醇、21
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脱氧皮质醇、皮质醇和皮质酮的浓度。
[0013]进一步的，所述标准曲线制品的系列浓度为8个，依次为0.5ng/mL、2.5ng/mL、12.5ng/mL、25ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、20ng/mL和400ng/mL。
[0014]进一步的，所述质控品包括低浓度、高浓度两套质控品。
[0015]进一步的，所述标准曲线制品的制备方法为在空白全血中加入六种相关类固醇激素的混合内标准品，配制成含不同浓度混合内标准品的全血溶液；取50μL含不同浓度混合内标准品的全血溶液在采集卡上，通风橱内晾干4h以上后，密封保存。
[0016]进一步的，步骤S2中所述有机溶剂为甲醇。
[0017]进一步的，步骤S3中提取样本的具体方式为分别将标准曲线制品以及待测样本干血斑打出血点，放入96孔V型板对应孔中，每个样本每孔需2个血点，然后将96孔V型板盖上封口膜，并密封。
[0018]进一步的，步骤S3中所述孵育的条件为孵育温度25～40℃、孵育转速500rpm～700rpm、孵育时间35～70分钟。
[0019]进一步的，步骤S4中浓缩的具体方式为对孵育后的样本以4000rpm离心5min，吸取150μL上清液加入另一空白96孔V型板中，采用氮气吹干的方式进行浓缩；复溶的具体方式为加入75μL的50％甲醇，密封后震荡，然后在4℃，4000rpm离心2分钟，取上清液为复溶液；
[0020]进一步的，步骤S5中液相色谱串联质谱仪的色谱条件为：流动相包括流动相一和流动相二，所述流动相一由水中添加乙酸铵和甲酸制成；所述流动相二由甲醇中添加乙酸铵和甲酸制成；色谱柱温为40～55℃。
[0021]优选的，所述流动相一为2～3mmol/L乙酸铵+0.1～12％甲酸的水溶液；所述流动相二为2～3mmol/L乙酸铵+0.1～12％甲酸的甲醇溶液。
[0022]进一步的，步骤S5中液相色谱串联质谱仪的质谱条件为：检测方式：多反应监测；毛细管电压：2.8～3KV；离子源温度：100～200℃；脱溶剂气温度：550～600℃；锥孔气流：100～200L/Hr；脱溶剂气流：1000～1200L/Hr。
[0023]本专利技术的有益效果为：本专利技术提供了一种可以同时测定CAH六种相关类固醇激素的方法，六种相关类固醇激素为17α
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羟孕酮、雄烯二酮、11
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脱氧皮质醇、21
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脱氧皮质醇、皮质醇和皮质酮。本专利技术能够有效提高CAH筛查的特异性和阳性预测值。检测分析物中包含皮质酮，使得CAH筛查更有效的区分11
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OHD和21
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OHD，提高本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种同时测定CAH六种相关类固醇激素的方法，所述六种相关类固醇激素为17α
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羟孕酮、雄烯二酮、11
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脱氧皮质醇、21
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脱氧皮质醇、皮质醇和皮质酮；其特征在于，包括以下步骤：步骤S1：分别制备混合内标准品、质控品和标准曲线制品：所述混合内标准品为17α
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羟孕酮同位素内标准品、雄烯二酮同位素内标准品、11
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脱氧皮质醇同位素内标准品、21
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脱氧皮质醇同位素内标准品、皮质醇同位素内标准品和皮质酮同位素内标准品的混合物；所述质控品为含有已知浓度的17α
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羟孕酮、雄烯二酮、11
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脱氧皮质醇、21
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脱氧皮质醇、皮质醇和皮质酮六种类固醇激素的人全血滤纸干血片；所述标准曲线制品为含有已知系列浓度的17α
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羟孕酮、雄烯二酮、11
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脱氧皮质醇、21
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脱氧皮质醇、皮质醇和皮质酮六种类固醇激素的人全血滤纸干血片；步骤S2：制备样本提取液：在混合内标准品中加入有机溶剂，溶解后稀释；步骤S3：提取和孵育样本：用样本提取液分别提取标准曲线制品以及待测样本，然后进行孵育；步骤S4：浓缩复溶样本：分别对孵育后的上清液进行浓缩后，并加入50％甲醇复溶，得到复溶液；步骤S5：测试：用液相色谱串联质谱仪对复溶液进行测定，绘制校准曲线，计算待测样本中17α
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羟孕酮、雄烯二酮、11
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脱氧皮质醇、21
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脱氧皮质醇、皮质醇和皮质酮的浓度。2.根据权利要求1所述的同时测定CAH六种相关类固醇激素的方法，其特征在于，所述标准曲线制品的系列浓度为8个，依次为0.5ng/mL、2.5ng/mL、12.5ng/mL、25ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、20ng/mL和400ng/m...

【专利技术属性】
技术研发人员：方炳雄，陈福，蔡勉珊，赵炜，田沛润，刘琪，赵梅，
申请(专利权)人：普宁市人民医院，
类型：发明
国别省市：