一种植物油料油脂甾醇含量的速测方法及速测试剂盒技术

本发明专利技术涉及一种植物油料油脂甾醇含量的速测方法及速测试剂盒。速测方法：提供植物油料油脂样品的甾醇提取溶液，用甾醇提取液稀释用缓冲液稀释得到样液，取样液加入到甾醇测试板中，加入甾醇氧化酶进行振荡反应，基于甾醇测试板的溶液颜色深浅与甾醇含量成正相关，获得植物油料油脂甾醇含量。本发明专利技术的方法操作简便、测试速度快，费用低，适用于植物油料油脂中甾醇含量的快速检测，为高甾醇材料筛选、品种选育和加工企业原料产品质量控制提供技术支撑。撑。

【技术实现步骤摘要】
一种植物油料油脂甾醇含量的速测方法及速测试剂盒


[0001]本专利技术属于农产品质量安全检测领域，具体涉及一种植物油料油脂甾醇含量的速测方法及速测试剂盒。

技术介绍

[0002]中国是油料油脂的生产大国和消费大国，植物油料油脂是人类膳食甾醇的主要来源，其提供的植物甾醇占膳食甾醇总摄入量40％，因此测定植物油料油脂中的甾醇含量具有重要意义。
[0003]植物甾醇是以环戊烷多氢菲为骨架的三萜类化合物，是油料作物的一组特异性次生代谢物，广泛存在于植物的根、茎、叶、果实和种子中。目前已报道的植物甾醇超过200多种，其中以β
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谷甾醇、豆甾醇、菜油甾醇和菜籽甾醇最为常见。植物甾醇是植物在生长过程中产生的一种次级代谢产物，具有降低胆固醇、抗氧化、抗炎症、增强免疫力等作用，对心血管疾病、癌症等慢性疾病具有很好的预防及治疗效果，受到国内外学者的广泛关注。植物甾醇在植物油中的含量和组成能够反映油料的种类。植物甾醇在不同油料作物和植物油中的组成和含量不同，因此可将其作为衡量植物油品质的特异性标志物。
[0004]目前，油料油脂中甾醇含量测定大多采用GC、GC
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MS、HPLC或HPLC
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MS等检测技术，实现甾醇分量以及甾醇总量的准确测定，上述方法检测准确、灵敏度高，广泛应用于油料油脂中甾醇的定性定量分析以及基于甾醇组成的食用油掺伪鉴别等。但这些方法需要借助大型仪器，耗时较长、成本高，无法实现快速检测。因此，急需一种现场快速检测植物油料油脂甾醇检测方法。
专利
技术实现思路

[0005]本专利技术所要解决的技术问题是提供一种植物油料油脂甾醇含量的速测方法及速测试剂盒。
[0006]为解决上述技术问题，本专利技术采用的技术方案为：
[0007]一种植物油料油脂甾醇含量速测试剂盒，包括甾醇提取液稀释用缓冲液、甾醇氧化酶和甾醇测试板，所述甾醇氧化酶用于催化提取液中甾醇产生过氧化氢，所述甾醇测试板中固定有冻干显色剂，所述的冻干显色剂包括辣根过氧化物酶、柠檬酸、冻干保护剂和3,3',5,5'
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四甲基联苯胺(TMB)，质量比为：8～250；3.5～10.5；0.6～3.0；15～50；所述的冻干保护剂由蔗糖和牛血清白蛋白以及，吐温20或十二烷基苯磺酸钠(SDS)组成。
[0008]按上述方案，所述冻干保护剂中：蔗糖；牛血清白蛋白；吐温20或十二烷基苯磺酸钠(SDS)为0.3～1.5；0.15～0.75；0.15～0.75。
[0009]按上述方案，甾醇提取液稀释用缓冲液为：0.05～0.10mol/L pH 7.0的2
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(N
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吗啉代)乙磺酸水溶液。
[0010]按上述方案，所述的冻干显色剂为由辣根过氧化物酶水溶液、柠檬酸水溶液、3,3',5,5'
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四甲基联苯胺(TMB)无水乙醇溶液和含蔗糖、牛血清白蛋白、吐温20或十二烷基
苯磺酸钠(SDS)的溶液混合冻干得到。
[0011]具体制备方法如下：配置辣根过氧化物酶水溶液，柠檬酸水溶液，冻干保护液， 3,3',5,5'
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四甲基联苯胺(TMB)乙醇溶液，混合，冻干，混合体系中：各物质的浓度范围：8 ～250mg/mL，3.5～10.5mg/ml，0.6～3.0mg/mL，15～50mg/mL；所述的冻干保护液中各组分的浓度为：0.3～1.5mg/mL蔗糖、0.15～0.75mg/mL牛血清白蛋白、0.15～0.75mg/mL 吐温20或0.15～0.75mg/mL十二烷基苯磺酸钠。
[0012]按上述方案，所述的甾醇测试板上设有微孔；所述的真空冷冻干燥为：直接置于甾醇测试板上的微孔中冻干，得到装载有冻干显色剂的甾醇测试板。
[0013]一种植物油料油脂甾醇含量的速测方法，步骤如下：提供植物油料油脂样品的甾醇提取溶液，用甾醇提取液稀释用缓冲液稀释得到样液，取样液加入到植物油料油脂甾醇含量的甾醇测试板中，加入甾醇氧化酶进行振荡反应，基于甾醇测试板的溶液颜色深浅与甾醇含量成正相关，获得植物油料油脂甾醇含量；
[0014]其中：所述甾醇测试板中固定有冻干显色剂，所述的冻干显色剂包括辣根过氧化物酶、柠檬酸、冻干保护剂和3,3',5,5'
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四甲基联苯胺，质量比为8～250：3.5～10.5：0.6～3.0：5～ 50；所述的冻干保护剂由蔗糖和牛血清白蛋白以及，吐温20或十二烷基苯磺酸钠组成。
[0015]按上述方案，所述振荡反应时间30～60min，振荡反应温度为37～42℃。
[0016]按上述方案，所述样液的用量为100～150μL。
[0017]按上述方案，所述甾醇氧化酶的用量为10～50μL，浓度为15～25U/mL。
[0018]按上述方案，所述植物油料油脂样品为：油菜、花生、大豆等植物油料样品以及食用植物油样品。
[0019]按上述方案，样品提取方法可根据检测需要进行选择。
[0020]具体地，所述的植物油料油脂甾醇含量检测中：
[0021]提取植物油料油脂样品中的总甾醇，进行样品中甾醇总量的检测；
[0022]或提取植物油料油脂样品中的游离甾醇，进行样品中游离甾醇含量的检测。
[0023]按上述方案，所述的甾醇氧化酶为胆固醇氧化酶，酶活力≥25U/mg，具体可采用重组大肠杆菌表达的胆固醇氧化酶。
[0024]按上述方案，所述的定量检测为用标准品β
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谷甾醇浓度建立标准工作曲线，将待测样品检测信号代入标准曲线可直接得到样品中甾醇含量。
[0025]按上述方案，定量检测具体为：使用酶标仪检测，基于酶标仪检测OD值和标准品甾醇浓度绘制标准曲线，基于标准曲线定量检测获得甾醇含量。
[0026]按上述方案，所述的酶标仪检测特征波长为450nm。
[0027]油料油脂中甾醇含量测定大多采用GC、GC
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MS、HPLC或HPLC
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MS等检测技术，进行甾醇分量以及甾醇总量的测定，但这些方法需要借助大型仪器，耗时较长、成本高，无法实现快速检测。甾醇结构与胆固醇类似，现有技术偶有利用胆固醇氧化酶检测甾醇的方法的报道，但反应步骤多，时间长，且检测试剂均需现配现用、无法满足现场快速检测的需求。
[0028]本专利技术通过将辣根过氧化物酶、3,3',5,5'
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四甲基联苯胺配合柠檬酸水溶液、蔗糖、牛血清白蛋白、吐温20或十二烷基苯磺酸钠(SDS)获得缓冲反应体系，混合冻干获得冻干显色剂，多组分、多体系试剂高效共存，利用甾醇氧化酶，具体可使用胆固醇氧化酶(植物
甾醇结构与胆固醇相似)，催化β
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谷甾醇、豆甾醇、菜油甾醇等植物甾醇产生过氧化氢，过氧化氢催化甾醇测试板中显色剂辣根过氧化物酶和3,3',5,5'
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四甲基联苯胺产生可溶性蓝色产物，基于甾醇测试板的溶液颜色深浅与甾醇含本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种植物油料油脂甾醇含量的速测试剂盒，其特征在于：包括甾醇提取液稀释用缓冲液、甾醇氧化酶和甾醇测试板，所述甾醇氧化酶用于催化提取液中甾醇产生过氧化氢，所述甾醇测试板中装载有冻干显色剂，所述的冻干显色剂包括辣根过氧化物酶、柠檬酸、冻干保护剂和3,3',5,5'
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四甲基联苯胺，质量比为8～250：3.5～10.5：0.6～3.0：5～50；所述的冻干保护剂由蔗糖和牛血清白蛋白以及，吐温20或十二烷基苯磺酸钠组成。2.根据权利要求1所述的速测试剂盒，其特征在于：所述冻干保护剂中：蔗糖；牛血清白蛋白；吐温20或十二烷基苯磺酸钠为0.3～1.5：0.15～0.75：0.15～0.75。3.根据权利要求1所述的速测试剂盒，其特征在于：所述的甾醇提取液稀释用缓冲液为：0.05～0.10mol/L pH 7.0的2
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(N
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吗啉代)乙磺酸水溶液。4.根据权利要求1所述的速测试剂盒，其特征在于：所述的冻干显色剂为由辣根过氧化物酶水溶液、柠檬酸水溶液、3,3',5,5'
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四甲基联苯胺无水乙醇溶液和含蔗糖、牛血清白蛋白、吐温20或十二烷基苯磺酸钠的溶液混合冻干得到，具体制备方法如下：配置辣根过氧化物酶水溶液，柠檬酸水溶液，冻干保护液，3,3',5,5'
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四甲基联苯胺乙醇溶液，混合，冻干，混合体系中：各物质的浓度范围：8～250mg/mL，3.5～10.5mg/ml，0.6～3.0mg/mL，15～50mg/mL；其冻干保护液由0.3～1.5mg/mL蔗糖、0.15～0.75mg/mL牛血清白蛋白、0.15～0.75mg/mL吐温20或0.15～0.75mg/mL十二烷基苯磺酸钠水溶液组成；所述的甾醇测试板上设有微孔；所述的冻干保护液直接置于甾醇测试板上的微孔中冻干，得到装载有冻干显色剂的甾...

【专利技术属性】
技术研发人员：王督，张良晓，马飞，张奇，姜俊，唐晓倩，李培武，
申请(专利权)人：中国农业科学院油料作物研究所，
类型：发明
国别省市：