本发明专利技术提供一种非编码RNA SNHG17作为标志物和治疗靶点的用途，属于肿瘤生物治疗领域，公开了一种非编码RNA SNHG17在制备预测乳腺癌氟维司群耐药的检测剂中的用途，该非编码RNA SNHG17的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，还公开了抑制非编码RNA SNHG17表达的shRNA的用途，该shRNA的编码序列如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示，或SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示，能够有效敲低非编码RNA SNHG17的表达，从而提高耐药乳腺癌细胞对氟维司群的敏感性，具备良好的药物开发前景。备良好的药物开发前景。备良好的药物开发前景。
【技术实现步骤摘要】
NO.4所示。
[0012]一种药物组合物，包括氟维司群，还包括上述的一种shRNA或上述的一种构建物，以及药学上可接受的载体和/或辅料。
[0013]在某些实施方案中，上述构建物的剂型为冻干剂型。
[0014]与现有技术相比，本专利技术的有益效果为：基于非编码RNA SNHG17在不同乳腺癌组织中的异常表达，通过检测样本中非编码RNA SNHG17能够帮助判断样本中乳腺癌细胞是否对氟维司群耐药，从而制定更为有效的治疗方案，提高治疗效果；此外，本专利技术还提供一种敲低非编码RNA SNHG17的shRNA，通过敲低非编码RNA SNHG17表达实现乳腺癌氟维司群耐药的逆转，提高乳腺癌对氟维司群的敏感性，提高治疗效果。
附图说明
[0015]图1为本专利技术实施例1中MCF
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7及MCF
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7R细胞中SNHG17的相对表达量；图2为本专利技术实施例1中细胞中SNHG17的荧光原位杂交图；图3为本专利技术实施例2中SNHG17过表达乳腺癌细胞中SNHG17的相对表达量；图4为本专利技术实施例2中细胞的集落形成；图5为本专利技术实施例2中氟维司群对乳腺癌细胞的生长抑制率；图6为本专利技术实施例3中细胞中SNHG17的相对表达量；图7为本专利技术实施例3中细胞的集落形成；图8为本专利技术实施例4中K1组、K2组、K3组、K4组慢病毒载体冻干后的生物滴度对比图；图9为本专利技术实施例4中K1组、K2组、K3组、K4组的冻干存活率对比图；图10为本专利技术实施例4中
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20℃保存3个月的慢病毒载体的滴度回收率；图11为本专利技术实施例4中23℃保存20天的慢病毒载体的滴度回收率；图12为本专利技术实施例4中4℃保存30天的慢病毒载体的滴度回收率。
具体实施方式
[0016]应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本专利技术提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本专利技术所属
的普通技术人员通常理解的相同含义。
[0017]需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本专利技术的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式。
[0018]为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本专利技术的技术方案，以下结合实施例对本专利技术作进一步详细描述：实施例1：1、检测在氟维司群敏感乳腺癌细胞系、氟维司群耐药乳腺癌细胞系中长非编码RNA SNHG17的表达水平。MCF
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7为氟维司群敏感乳腺癌细胞系；MCF
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7R为氟维司群耐药乳腺癌细胞系。
[0019]1.1 MCF
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7细胞从ATCC细胞库获得，将MCF
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7细胞培养于含10wt%胎牛血清的DMEM
完全培养基，培养基加入200U/mL青霉素及200U/mL链霉素。
[0020]1.2 MCF
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7R细胞系的构建：取对数生长期的MCF
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7细胞1
×
107个，接种于直径为10cm的培养皿（以含10wt%胎牛血清、青霉素200U/mL、链霉素200U/mL的DMEM完全培养基为培养液），待细胞生长稳定后于培养液中加入1μmol/L氟维司群，每48h换液后加入等浓度的氟维司群，12个月后通过有线稀释法获得乳腺癌MCF
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7氟维司群耐药的单克隆细胞株（称为MCF
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7R），进而在无药物干预下进行扩增，为了维持MCF
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7R的耐药性，后期培养于含有0.5μmol/L的氟维司群培养液中。
[0021]1.3 RT
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PCR检测MCF
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7、MCF
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7R细胞中的SNHG17表达水平：1.3.1用Trizol法分别提取总RNA：分别取MCF
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7、MCF
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7R细胞放入1.5mL离心管中，2mL PBS洗涤2次，加入1mL Trizol，移液枪反复吹打20下，确保细胞全部裂解，然后吸至1.5mL离心管中；室温放置5分钟，使样品充分裂解，加入0.2mL氯仿，猛烈晃动10s，室温放置2min；12000g 4℃离心15min，吸取上层无色水相移至新的离心管，加入0 .5ml异丙醇，颠倒混匀，冰上放置10分钟；12000g 4℃离心10min，可见管底的RNA沉淀，小心吸去上清；加入1mL 75v/v%乙醇（DEPC水配制），颠倒混匀，7500g 4℃离心5min，小心吸去上清；加入20μL DEPC水溶解，Nanodrop分光光度计定量并质检，
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80℃保存待用。
[0022]1.3.2反转录：加入2μg总RNA，1μL随机引物，加入DEPC水至12μL，在68℃ 孵育5min。取出产物后立即放置冰上4min，分别加入4μL Reaction Buffer，2μL 10mM dNTP Mix ，1μL Reverse Transcriptase，M
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MLV
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Reverse和1μL RNase Inhibitor。在42℃水浴60min，再置于70℃水浴15min，立即放在冰上，静置5min，得cDNA模板，于
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20℃下保存。
[0023]1.3.3实时荧光定量PCR检测SNHG17表达量：SNHG17和β
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acting的引物如表1所示。
[0024]表1 荧光定量PCR引物序列取各组细胞的cDNA 1μL为模板，进行PCR反应，PCR反应体系（10μL）见表2：表2 PCR反应体系（10μL）反应条件为：95℃预变性3min；以95℃变性15s，60℃退火30s，72℃延伸30s，扩增40个循环，再以72℃充分延伸10min。以GAPDH为内参基因，用2
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ΔΔCT
法计算SNHG17的相对表达量。MCF
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7及MCF
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7R细胞中SNHG17的相对表达量见图1，其中A为MCF
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7亲本细胞，B为MCF
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7R耐药细胞，**P < 0.01表示有统计学意义。
[0025]由图1可以看出，MCF
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7亲本细胞中长非编码RNA SNHG17的表达水平明显小于MCF
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7R耐药细胞，说明耐药性氟维司群敏感乳腺癌细胞系中长非编码RNA SNHG17的表达水平比氟维司群耐药乳腺癌细胞系更高。
[0026]1.4荧光原位杂交（FISH）实验：1.4.1分别取MCF
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7、MCF
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7R细胞1
×
103接种于6孔板的玻璃盖板上，37℃培养过夜，用1ｘPBS清洗细胞两次，加入1mL 4g/mL%多聚甲醛固定15min，将悬液涂在粘附性玻片上，每片约50μL的悬液；60℃恒温干燥箱烘片10min，得到细本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种抑制非编码RNA SNHG17表达的shRNA在制备逆转氟维司群耐药的药物中的用途，其特征在于：所述shRNA的编码序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示，或SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。2.一种构建物在制备增加乳腺癌细胞对氟维司群敏感性的药物中的用途，其特征在于：所述构建物由权利要求1所述的shRNA插入慢病毒载体质粒pLKO.1
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GFP
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Puro所得。3.一种非编码RNA SNHG17在制备预测乳腺癌氟维司群耐药的检测剂中的用途。4.根据权利要求3所述的用途，其...
【专利技术属性】
技术研发人员：雷蕾，王晓稼，
申请(专利权)人：浙江省肿瘤医院，
类型：发明
国别省市：
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