抗病毒活性增强的纳米穿孔器制造技术

本发明专利技术涉及通过纳米穿孔器的结构修饰或改善来提高病毒感染预防及治疗功效的纳米穿孔器，本发明专利技术的纳米穿孔器的结构、面积、形状及膜支架蛋白的特异性被修饰，因此具有提高的热稳定性，并且，通过增加穿孔作用的效率、增强纳米穿孔器的稳定性及赋予病毒特异性来使抗病毒活性最大化，因此可有效用作用于预防或治疗病毒感染的药物组合物。病毒感染的药物组合物。病毒感染的药物组合物。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】抗病毒活性增强的纳米穿孔器


[0001]本专利技术涉及通过纳米穿孔器的结构修饰或改善来提高病毒感染预防及治疗功效的纳米穿孔器。

技术介绍

[0002]迄今为止开发的病毒感染治疗剂包括金刚烷胺(amantadine)或金刚乙胺(rimantadine)类M2离子通道抑制剂、奥司他韦(oseltamivir，商品名为达菲)或扎那米韦(zanamivir，商品名为瑞乐砂)类神经氨糖酸苷酶(neuraminidase)抑制剂，但这些治疗剂存在有效性有限的问题。即，金刚烷胺或金刚乙胺类衍生化合物快速产生耐药性变异病毒，已知部分地区检测到的H5N1型流感病毒对金刚烷胺或金刚乙胺类化合物具有耐药性，乙型流感病毒对金刚烷胺衍生物不敏感。并且，已知对奥司他韦或扎那米韦类衍生化合物产生耐药性的病毒也会增加，并且这些耐药性病毒在儿童中经常发生。
[0003]正在积极进行研究以开发一种新的治疗剂，它不存在治疗如上所述的现有病毒感染的问题。例如，韩国专利第1334143号公开了一种包含远志(Polygala karensium)提取物和从中分离的呫吨酮类化合物的用于预防或治疗感冒、禽流感、猪流感或甲型流感的组合物。然而，这些制剂的抗病毒活性较低，因此对甲型流感没有有效的预防或治疗效果。
[0004]最近，作为纳米圆盘的一种新应用方法，有报道称其具有作为抗病毒剂的潜力，例如防止具有脂质双层包膜的病毒感染或抑制受感染病毒的增殖等，上述纳米圆盘也称为纳米穿孔器(Nano
‑
perforator，NP)。上述病毒利用脂质双层包膜中的膜结合蛋白感染宿主细胞，利用纳米穿孔器打断上述病毒的感染途径或直接刺破病毒表面，从而可抑制病毒的增殖。金刚烷胺、奥司他韦(商品名为达菲)、扎那米韦(商品名为瑞乐砂)等已开发的病毒治疗剂的效果有限，有效治疗存在局限性，例如病毒变得耐药或出现耐药性病毒等。上述纳米穿孔器不含在体内诱导特异性反应的物质，因此安全，并且具有可以普遍应用于各种变异病毒的优点，因此正在进行积极的研究。
[0005]因此，本专利技术人通过对纳米穿孔器进行各种修饰，进一步提高抗病毒功效和增加热稳定性，从而完成了本专利技术。

技术实现思路

[0006]技术问题
[0007]本专利技术的目的在于，提供抗病毒效果增强的纳米穿孔器。
[0008]并且，本专利技术的目的在于，提供用于预防或治疗病毒感染的药物组合物。
[0009]并且，本专利技术的目的在于，提供纳米穿孔器的制备方法。
[0010]解决问题的方案
[0011]为了解决上述问题，本专利技术提供包含环状膜支架蛋白的纳米穿孔器。
[0012]并且，本专利技术提供由两个纳米穿孔器通过共价键连接而成的双纳米穿孔器。
[0013]并且，本专利技术提供用于预防或治疗病毒感染的药物组合物，包含抗病毒效果增强
的纳米穿孔器。
[0014]并且，本专利技术提供本专利技术的纳米穿孔器的制备方法。
[0015]专利技术的效果
[0016]本专利技术的纳米穿孔器的结构、面积、形状及膜支架蛋白的特异性被修饰，因此具有提高的热稳定性，并且，通过增加穿孔作用的效率、增强纳米穿孔器的稳定性及赋予病毒特异性来使抗病毒活性最大化，因此可有效用作用于预防或治疗病毒感染的药物组合物。
附图说明
[0017]图1为环状膜支架蛋白(esMSP)质粒的结构示意图。
[0018]图2为确认经纯化的esMSP蛋白及其环状结构的图。
[0019]图3为使用分选酶比较环状膜支架蛋白的纯化过程和esMSP蛋白的纯化过程并通过LAL检测(LAL assay)对通过该方法生产的每mg蛋白esMSP的内毒素浓度进行测定的图(对照组ApoA
‑
1或MSP1E3D1)。
[0020]图4为分析esMSP的热稳定性的图。
[0021]图5为eslMSP蛋白的结构示意图。
[0022]图6为确认经纯化的eslMSP蛋白及其环状结构的图。
[0023]图7为确认MSP
‑
CfaN及CfaC
‑
MSP的反式剪接(trans
‑
splicing)产物的图(箭头：MSP
‑
MSP结合物)。
[0024]图8为能够与抗体结合的FcMSP的结构示意图。
[0025]图9为确认经纯化的MSP蛋白(左：32.6KDa)及包含Fc结合结构域的FcMSP(右：35.2KDa)的图。
[0026]图10为Fc
‑
eslMSP蛋白的结构示意图。
[0027]图11为示出用于确认Fc
‑
eslMSP蛋白的纯化及Fc
‑
eslND的形成的SDS
‑
PAGE结果的图。
[0028]图12为示出NP(ND)及esNP(esND)的SEC结果的图。
[0029]图13为ND与eslND的SEC及DLS结果和比较示意图。
[0030]图14为示出用于确认双纳米穿孔器(Di
‑
ND或Di
‑
NP)的形成的SEC、SDS
‑
PAGE及DLS结果的图。
[0031]图15为示出FcND的SEC及SDS
‑
PAGE结果的图。
[0032]图16为示出Fc
‑
eslND的SEC结果的图。
[0033]图17为示出用于确认通过二硫键结合的双环状纳米穿孔器esdND的形成条件的DLS及SEC结果的图：
[0034]esND
‑
TCEP_Di
‑
form：在esMSP的纯化和ND的形成过程中未添加还原剂的通过二硫键结合的双纳米穿孔器；
[0035]after TCEP treat：对通过二硫键结合的双环状纳米穿孔器esdND处理还原剂TCEP后分析的DLS结果；
[0036]esND
‑
TCEP single
‑
form：esMSP的纯化和ND的形成过程中添加还原剂TCEP后形成的单纳米穿孔器；以及
[0037]after TCEP treat：对单纳米穿孔器esND处理还原剂TCEP后分析的DLS结果。
[0038]图18为将用于确认通过二硫键结合的双环状纳米穿孔器esdND的形成的图14的结果简要示出的esND(用essND标记)及esdND的制备示意图。
[0039]图19为对用于确认双环状纳米穿孔器的增强的抗病毒功效的致细胞病变效应(Cytopathic effect，CPE)抑制效果进行确认的图：
[0040]上端：通过二硫键结合的双环状纳米穿孔器(esdNPTG)与单纳米穿孔器相比增强的抗病毒功效；以及
[0041]下端：通过共价键结合的双环状纳米穿孔器(Di
‑
NPTG)与单纳米穿孔器相比增强的抗病毒功效。...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种质粒，其特征在于，包含编码融合蛋白的碱基序列，上述融合蛋白由内含肽的N
‑
末端结构域与膜支架蛋白的C
‑
末端融合且内含肽的C
‑
末端结构域与膜支架蛋白的N
‑
末端融合而成。2.根据权利要求1所述的质粒，其特征在于，包含编码融合蛋白的碱基序列，上述融合蛋白包含两个以上重复的膜支架蛋白。3.一种质粒，其特征在于，包含编码融合蛋白的碱基序列，上述融合蛋白由内含肽的C
‑
末端结构域与膜支架蛋白的N
‑
末端融合而成。4.一种质粒，其特征在于，包含编码融合蛋白的碱基序列，上述融合蛋白由内含肽的N
‑
末端结构域与膜支架蛋白的C
‑
末端融合而成。5.一种质粒，其特征在于，包含编码Fc区结合肽及膜支架蛋白的融合蛋白的碱基序列。6.根据权利要求5所述的质粒，其特征在于，内含肽的N
‑
末端结构域与融合蛋白的C
‑
末端融合，内含肽的C
‑
末端结构域与融合蛋白的N
‑
末端融合。7.一种质粒，其特征在于，包含编码Fc区结合肽及两个以上重复的膜支架蛋白的融合蛋白的碱基序列，内含肽的N
‑
末端结构域与上融合蛋白的C
‑
末端融合，内含肽的C
‑
末端结构域与上融合蛋白的N
‑
末端融合。8.一种质粒，其特征在于，包含编码Fc区结合肽及膜支架蛋白的融合蛋白的碱基序列，内含肽的C
‑
末端结构域与上述融合蛋白的N
‑
末端融合。9.一种质粒，其特征在于，包含编码Fc区结合肽及膜支架蛋白的融合蛋白的碱基序列，内含肽的N
‑
末端结构域与上述融合蛋白的C
‑
末端融合。10.一种环状膜支架蛋白，其特征在于，通过表达并纯化权利要求1所述的质粒来获得，上述环状膜支架蛋白的N
‑
末端与C
‑
末端剪接。11.根据权利要求10所述的环状膜支架蛋白，其特征在于，通过表达权利要求1所述的质粒并经还原剂处理来纯化蛋白质而制成。12.一种双环状膜支架蛋白，其特征在于，由两个环状膜支架蛋白通过二硫键连接而成。13.根据权利要求12所述的双环状膜支架蛋白，其特征在于，通过表达权利要求1所述的质粒并未经还原剂处理而纯化。14.一种大环状膜支架蛋白，其特征在于，通过表达并纯化权利要求2所述的质粒来获得。15.一种融合蛋白，其特征在于，通过表达并纯化权利要求3所述的质粒来获得，上述融合蛋白由内含肽的C
‑
末端结构域与膜支架蛋白的N
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末端融合而成。16.一种融合蛋白，其特征在于，通过表达并纯化权利要求4所述的质粒来获得，上述融合蛋白由内含肽的N
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末端结构域与膜支架蛋白的C
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末端融合而成。17.一种能够与抗体结合的膜支架蛋白，其特征在于，通过表达并纯化权利要求5所述的质粒来获得。18.根据权利要求17所述的能够与抗体结合的膜支架蛋白，其特征在于，内含肽的N
‑
末端结构域与F...

【专利技术属性】
技术研发人员：权大赫，郑泳薰，文硕梧，吴泫锡，柳晳现，黄在贤，
申请(专利权)人：MVRIX株式会社，
类型：发明
国别省市：