确定多肽与siRNA共组装体中最小包载结合比的方法技术

本发明专利技术属于生物工程领域，具体涉及一种确定多肽与siRNA共组装体中最小包载结合比的方法。本发明专利技术公开了一种确定多肽与siRNA共组装体中最小包载结合比的方法，包括：S1：配制2％的琼脂糖凝胶；S2：制备CPP

【技术实现步骤摘要】
确定多肽与siRNA共组装体中最小包载结合比的方法


[0001]本专利技术属于生物工程领域，具体涉及一种确定多肽与siRNA共组装体中最小包载结合比的方法。
技术背景
[0002]RNAi(RNA干扰)是在研究秀丽新小杆线虫(C.elegans)反义RNA(antisense RNA)的过程中发现的，由dsRNA介导的同源RNA降解过程。RNA干扰是指在进化过程中高度保守的、由双链RNA(double
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stranded RNA，dsRNA)诱发的、同源mRNA高效特异性降解的现象。基因沉默，主要有转录前水平的基因沉默(TGS)和转录后水平的基因沉默(PTGS)两类:TGS是指由于DNA修饰或染色体异染色质化等原因使基因不能正常转录；PTGS是启动了细胞质内靶mRNA序列特异性的降解机制。有时转基因会同时导致TGS和PTGS。
[0003]由于RNA干扰技术能高效、特异的沉默疾病相关基因，使其已逐渐被发展成为新型的治疗遗传性或获得性疾病包括病毒感染和癌症等的基因治疗手段，到目前为止已经开展了大量利用siRNA进行疾病治疗的动物实验和临床实验。
[0004]虽然siRNA在体外应用研究中及细胞水平上显示出良好的沉默效果，但由于其巨大的分子量及自身所携带的大量负电荷使其不能自主穿越细胞膜进入细胞发挥作用，在系统运输时易引起非特异性的脱靶效应和免疫应答，同时还面临被核酸酶降解等障碍，导致在以治疗人类疾病为目的的siRNA体内系统运输面临着巨大的挑战。所以siRNA的转染问题成为限制其应用的主要瓶颈。
[0005]如何增强siRNA穿透细胞膜的能力，提高其在体内的稳定性和靶向性等都是siRNA药物载体急需解决的问题。因此设计和合成安全有效的siRNA药物载体已成为目前siRNA药物研发的重要方向。
[0006]与化学修饰的核酸相比，载体介导方法制定核酸疗法并保护其不被降解，显得简单快速。这些载体，包括病毒载体和非病毒载体，它们与siRNA共组装或者共价结合。这些载体可以加强细胞靶向，延长药物流通时间，提高膜的穿透性。
[0007]常见的非病毒基因药物的传递载体往往为带有正电的阳离子化合物，包括聚阳离子、正电磷脂、壳聚糖、白蛋白、树枝状大分子以及多肽等，它们通过带正电的基团中和DNA/RNA上的负电磷酸基团，从而将基因压缩保护成组装体颗粒，使得基因能够顺利通过各种障碍，诸如逃逸免疫系统、穿透细胞膜、从内含体释放等等，而完成基因传递。
[0008]多肽作为生物分子的一种，在作为基因载体上具有很多合成高分子不具备的优势：多肽有20种性质各异的氨基酸可以组成性质丰富的一级序列；有实验记载通过设计可以拿到beta折叠或者alpha螺旋等二级结构；通过固相合成可以拿到纯度高、分布单一、结构明确的分子；可以很方便的改性或者连入生物可识别功能的靶向序列提高专一性。
[0009]多肽已经被用于合成药物、小分子、生物活性肽、治疗性蛋白的传递，但是核酸机理尚未完全清楚。这些肽可以包括源于蛋白质的细胞穿膜肽(cell penetrating peptide,CPP)，阳离子肽，设计出的多肽化合物，融合肽，细胞靶向肽(cell targeting peptides，
CTP)以及包含核定位信号的肽(Nuclear localization signal,NLS)等。
[0010]多肽与siRNA组成的核酸药成为现在研究热点，有些药已经进入临床研究。多肽与siRNA在没有完全包载的情况下会影响体内外活性，因此新设计的多肽载体在进行体外实验前应先确定与siRNA自组装成带正电纳米颗粒的最小包载结合比，在最小结合比(包括)以上进行活性测试实验。然而迄今没有试验记载如何确定多肽与siRNA的最小包载结合比的实验方法，从而限制了siRNA的方法。

技术实现思路

[0011]本专利技术发现了一种确定多肽与siRNA的最小包载结合比的实验方法，填补了现有技术的空白。
[0012]具体的，本专利技术的技术方案如下：
[0013]本专利技术第一个方面公开了一种确定多肽与siRNA共组装体中最小包载结合比的方法，包括：
[0014]S1：配制2％的琼脂糖凝胶；
[0015]S2：制备CPP
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siRNA纳米颗粒；
[0016]S3：加入目标多肽，进行电泳实验，凝胶成像仪成像；肉眼观察成像结果中的图谱，挑选出图像中蛋白质电泳轨迹没有拖尾的组别，没有拖尾的组别中的最小结合比即为最小包载结合比。
[0017]应当理解，本专利技术在步骤S1之前、步骤S1和S2直接、步骤S3之后还可以有其他额外的步骤，且均在本专利技术的保护范围之内。
[0018]优选的，所述目标多肽的氨基酸序列选自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：5中的一种。
[0019]应当理解，本专利技术的目标多肽的氨基酸序列并不限于SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：5中的一种，本领域技术人员可以根据需要，设计不同的多肽序列来完成本专利技术，且均在本专利技术的保护范围之内。
[0020]在本专利技术的一些优选实施例中，在S1中，2％的琼脂糖凝胶配制方法如下：a、称量3.2g琼脂糖粉末放入烧杯，加1
×
TAE定容至160mL，轻微晃动混匀，放置微波炉中加热4
‑
7min，直至完全溶解，冷却片刻后加入GelRed Nucleic Acid Gel Stain(BIOTIUM；Cat:41003)染料使其工作浓度为1
×
；b、将溶解的琼脂糖倒入插入梳子的模具中，室温放置30min，拔掉梳子；c、将制成的凝胶放入电泳槽中，待加入目标多肽后进行电泳实验。
[0021]优选的，在S2中，分别配制CPP母液和siRNA母液，将不同摩尔比的CPP溶液和siRNA溶液进行混合，得到CPP
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siRNA纳米颗粒。
[0022]优选的，在S3中，所述电泳实验中，电压80
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100V，时间20
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40min。
[0023]在本专利技术的一些具体实施例中，在S3中，所述电泳实验中，电压90V，时间30min。
[0024]优选的，在加入目标多肽之前，在CPP
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siRNA纳米颗粒中加入甘油后混匀。
[0025]优选的，所述在CPP
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siRNA纳米颗粒中加入40％甘油。
[0026]优选的，所述siRNA的正义链和反义链的核苷酸序列分别如SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：7所示。
[0027]优选的，所述共组装体为共组装带正电纳米颗粒。
[0028]本专利技术第二个方面公开了上述的方法在药物制备领域中的应用；优选的，所述药物为核酸药。
[0029]多肽本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种确定多肽与siRNA共组装体中最小包载结合比的方法，其特征在于，包括：S1：配制2％的琼脂糖凝胶；S2：制备CPP
‑
siRNA纳米颗粒；S3：加入目标多肽，进行电泳实验，凝胶成像仪成像；肉眼观察成像结果中的图谱，挑选出图像中蛋白质电泳轨迹没有拖尾的组别，没有拖尾的组别中的最小结合比即为最小包载结合比。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述目标多肽的氨基酸序列选自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：5中的一种。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在S2中，分别配制CPP母液和siRNA母液，将不同摩尔比的CPP溶液和siRNA溶液进行混合，得到CPP
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siRNA纳米颗粒。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在S3中，所述电泳实验中，...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙婷婷，舒智愚，牟泉萌，陈璞，
申请(专利权)人：陈璞，
类型：发明
国别省市：