一种检测中药中外源有害物质的试剂、试剂盒和检测方法技术

本发明专利技术涉及一种检测中药中外源有害物质的试剂、试剂盒和检测方法，属于中药污染物检测技术领域。本发明专利技术所述试剂包括有害物质的核酸适配体和有害物质的核酸适配体的互补单链DNA；所述有害物质包括黄曲霉毒素B1、赭曲霉毒素A和甲拌磷；所述有害物质的适配体分别如SEQ ID NO.1～3所示；所述有害物质的核酸适配体的互补单链DNA分别如SEQ ID NO.4～6所示。本发明专利技术所述试剂能够实现中药中有害物质的高效检测，操作简单，成本低，准确性高且能够实现有害物质的定量检测。物质的定量检测。物质的定量检测。

【技术实现步骤摘要】
一种检测中药中外源有害物质的试剂、试剂盒和检测方法


[0001]本专利技术涉及中药污染物检测
，具体涉及一种检测中药中外源有害物质的试剂、试剂盒和检测方法。

技术介绍

[0002]中药材多来源于天然动植物，极易受有害物质污染，如真菌毒素、农药残留等。同时中药物质基础高度复杂，干扰物质种类繁多，污染物难以通过预处理去除。因此，实现中药样品中有害物质的有效检测具有很大难度。现有对于中药中外源污染物的检测手段主要有高效液相色谱法(HPLC)、酶联免疫吸附测定(enzyme
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linked immunosorbent assay，ELISA)、薄层色谱法(thin layer chromatography，TLC)、气相色谱
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质谱法(GC
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MS)、高效液相色谱
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质谱法(HPLC
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MS)等。HPLC、TLC等色谱技术检测前处理过程复杂，且难以精确定量；MS操作复杂，检测成本高。针对现有检测技术，其可靠性、灵敏度和检测通量上仍有较大提升空间。因此，中药有害物质检测领域需要一项操作相对简便，成本较低的高效检测方法。

技术实现思路

[0003]本专利技术的目的在于提供一种检测中药中外源有害物质的试剂、试剂盒和检测方法。本专利技术所述试剂能够实现中药中有害物质的高效检测，操作简单，成本低，准确性高且能够实现有害物质的定量检测。
[0004]本专利技术提供了一种检测中药中外源有害物质的试剂，所述试剂包括有害物质的核酸适配体和有害物质的核酸适配体的互补单链DNA；所述有害物质包括黄曲霉毒素B1、赭曲霉毒素A和甲拌磷；所述有害物质的核酸适配体包括核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的黄曲霉毒素B1适配体、核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的赭曲霉毒素A适配体和核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的甲拌磷适配体；所述有害物质的核酸适配体的互补单链DNA包括核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示的黄曲霉毒素B1适配体互补单链DNA、核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示的赭曲霉毒素A适配体互补单链DNA和核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示的甲拌磷适配体互补单链DNA；
[0005]所述有害物质的核酸适配体的5'端标记荧光淬灭基团BHQ1；
[0006]所述有害物质的核酸适配体的互补单链DNA的3'端标记荧光基团FAM。
[0007]优选的是，所述试剂的溶剂包括TE缓冲溶液。
[0008]本专利技术还提供了一种基于上述技术方案所述试剂的毛细管电泳检测中药中外源有害物质的试剂盒，所述试剂盒包括上述技术方案所述试剂、水、甲醇、毛细管检测用凝胶缓冲液和毛细管检测用运行缓冲液。
[0009]优选的是，所述毛细管检测用凝胶缓冲液包括ssDNA 100
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R Gel。
[0010]优选的是，所述毛细管检测用运行缓冲液包括三硼酸尿素缓冲液。
[0011]本专利技术还提供了一种基于上述技术方案所述试剂或上述技术方案所述试剂盒的
毛细管电泳检测中药中外源有害物质的方法，包括以下步骤：
[0012]1)在黑暗环境下，将浓度均为0.001～10ng/mL的黄曲霉毒素B1、赭曲霉毒素A和甲拌磷与上述技术方案所述试剂中有害物质的核酸适配体和有害物质的核酸适配体的互补单链DNA混合反应后，得到毛细管电泳加标样品溶液；设定激发波长为488nm，测得发射波长520nm下各类有害物质对应的荧光峰高度；将各浓度梯度有害物质对照荧光峰高度作线性回归，获得标准曲线；
[0013]2)将中药粉末与甲醇水溶液混合，离心取上清，得到中药样品溶液；
[0014]3)在黑暗环境下，将步骤2)得到的样品溶液与上述技术方案所述试剂中有害物质的核酸适配体和有害物质的核酸适配体的互补单链DNA混合反应后，得到毛细管电泳样品溶液；
[0015]4)将步骤3)得到的毛细管电泳样品溶液进行毛细管电泳，设定激发波长为488nm，测得发射波长520nm各荧光峰高度；
[0016]5)将步骤4)测得的荧光峰高度对照步骤1)标准曲线，计算获得中药样品溶液中有害物质的浓度。
[0017]优选的是，步骤2)所述甲醇水溶液中甲醇与水的体积比为(0.25～9)：1；所述中药粉末与甲醇水溶液的质量比为1：(2～500)。
[0018]优选的是，步骤3)中，各有害物质的核酸适配体和有害物质的核酸适配体的互补单链DNA的终浓度分别为0.01nM～1mM。
[0019]优选的是，步骤3)所述反应的时间为1～120min。
[0020]优选的是，步骤4)所述毛细管电泳条件为：进样时间0.2～30s，进样电压0.2～10kV；分离时间2～180min，分离电压0.5～50kV。
[0021]本专利技术提供了一种检测中药中外源有害物质的试剂。本专利技术所述试剂能够用于快速、高通量、前处理简单、准确性高的有害物质毛细管电泳检测。本专利技术毛细管电泳检测时，样品前处理方法简单，分离能力强，且操作简单，可在短时间内完成复杂有害物质体系成分分离。此外，本专利技术毛细管电泳检测结合荧光原理，基于荧光基团间荧光淬灭与恢复准确测定目标荧光信号，并将相同浓度的目标物信号强度放大数百倍，能够得到更精确的目标物定量结果并减少样品用量，灵敏度高。本专利技术还能够同时检测出中药中不同种类真菌毒素与农药残留，与传统检测方法相比，具有高通量检测特性，并可以对有害物质进行定量，具有很高的检测效率。
附图说明
[0022]图1为本专利技术提供的中药中外源有害物质黄曲霉毒素B1、赭曲霉毒素A和甲拌磷毛细管电泳检测原理示意图；
[0023]图2为本专利技术提供的毛细管电泳检测待测目标物、核酸适配体与互补单链DNA混合反应后荧光淬灭与恢复效果图。
具体实施方式
[0024]本专利技术提供了一种检测中药中外源有害物质的试剂，所述试剂包括有害物质的核酸适配体和有害物质的核酸适配体的互补单链DNA；本专利技术所述有害物质包括黄曲霉毒素
B1(aflatoxin B1，AFB1)、赭曲霉毒素A(ochratoxin A，OTA)和甲拌磷(Phorate)；所述有害物质的核酸适配体包括核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的黄曲霉毒素B1适配体：5'
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BHQ1
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GTTGGGCACGTGTTGTCTCTCTGTGTCTCGTGCCCTTCGCTAGGCCC
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3'、核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的赭曲霉毒素A适配体：5'
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BHQ1
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GATCGGGTGTGGGTGGCGTAAAGGGAGCATCGGACA
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3'和核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的甲拌磷适配体：5'
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BHQ1
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AGCTTGCTGCAGCGATTCTTGATCGCCACAGAGCT
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种检测中药中外源有害物质的试剂，其特征在于，所述试剂包括有害物质的核酸适配体和有害物质的核酸适配体的互补单链DNA；所述有害物质包括黄曲霉毒素B1、赭曲霉毒素A和甲拌磷；所述有害物质的核酸适配体包括核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的黄曲霉毒素B1适配体、核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的赭曲霉毒素A适配体和核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的甲拌磷适配体；所述有害物质的核酸适配体的互补单链DNA包括核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示的黄曲霉毒素B1适配体互补单链DNA、核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示的赭曲霉毒素A适配体互补单链DNA和核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示的甲拌磷适配体互补单链DNA；所述有害物质的核酸适配体的5'端标记荧光淬灭基团BHQ1；所述有害物质的核酸适配体的互补单链DNA的3'端标记荧光基团FAM。2.根据权利要求1所述的试剂，其特征在于，所述试剂的溶剂包括TE缓冲溶液。3.一种基于权利要求1或2所述试剂的毛细管电泳检测中药中外源有害物质的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1或2所述试剂、水、甲醇、毛细管检测用凝胶缓冲液和毛细管检测用运行缓冲液。4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述毛细管检测用凝胶缓冲液包括ssDNA 100
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R Gel。5.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述毛细管检测用运行缓冲液包括三硼酸尿素缓冲液。6.一种基于权利要求1或2所述试剂或权利要求3～5任一项所述试剂盒的毛细管电泳检测中药中外源有害物质的方法，包括以下步...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘伯实，张楠，李婧荣，张迪，刘睿，所同川，郑琳，李正，
申请(专利权)人：天津中医药大学，
类型：发明
国别省市：