一种治疗软组织损伤的可注射水凝胶细胞支架材料及其制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种治疗软组织损伤的可注射水凝胶细胞支架材料及其制备方法和应用，所述水凝胶内包覆有通过化学偶联反应负载在其上的释放生物大分子/免疫调节/抗氧化药物的具良好生物相容性的微米粒子/偶联在天然来源大分子上的生长因子。本发明专利技术注射水凝胶具有良好的生物相容性，与细胞疗法兼容，在损伤部位局部精确释放生物大分子/免疫调节/抗氧化药物/生长因子，阻止了脊髓损伤后囊性空腔的形成，减轻了神经炎症导致的二次损伤，保护了残留的脊髓神经组织和轴突，减少了胶质瘢痕组织的形成，促进移植细胞的存活与分化，为本体神经轴突的再生提供了一种可穿透性的细胞外基质环境，进而促进生理功能的恢复，可用于脊髓等软组织损伤的修复。等软组织损伤的修复。等软组织损伤的修复。

【技术实现步骤摘要】
一种治疗软组织损伤的可注射水凝胶细胞支架材料及其制备方法和应用


[0001]本专利技术涉及软组织修复工程
，具体涉及一种治疗脊髓损伤的可注射细胞载体水凝胶的制备及应用。

技术介绍

[0002]脊髓损伤(SCI)是一种严重致残性疾病，往往导致损伤节段以下肢体严重的生理功能障碍。脊髓损伤是脊柱损伤最严重的并发症，通常伴随着损伤节段以下的肢体严重功能障碍。 SCI不仅会给患者本人带来身体和心理的严重伤害，还会对整个社会造成巨大的经济负担。以干细胞为基础的组织工程技术，为修复受损的脊髓促进功能恢复带了希望 (Koffleretal.,2019/02,Nat.Med.)。但是，由于脊髓损伤急性期会在损伤部位分泌大量炎性因子，杀死移植的干细胞，降低干细胞移植的疗效。人工合成的干细胞支架材料，能抑制炎性反应，改善损伤部位抑制神经再生的微环境，提高移植干细胞的存活率，使其发挥更好的功效。但是这些人工合成的材料存在组织相容性差和细胞毒性比较大的问题，不适合用于干细胞支架材料，阻碍了它们在临床上的应用。

技术实现思路

[0003]专利技术目的：针对上述现有存在的问题和不足，本专利技术的目的是提供是一种治疗中枢神经损伤的可注射细胞载体水凝胶及其制备方法。该水凝胶可以同时负载不同的干细胞如间充质干细胞(MSCs)，具有生物相容性好，细胞毒性低等优点。水凝胶注射可以让脊髓受损后的动物运动功能恢复达到一个较高的水平。本专利技术开发了一种生物相容性良好的可精确缓释药物及生长因子的可注射细胞载体水凝胶体系，有望用于中枢神经损伤的临床治疗。
[0004]技术方案：为实现上述专利技术目的，本专利技术采用以下技术方案：一种治疗软组织损伤的可注射水凝胶细胞支架材料，以X基团修饰过的天然分子与多臂聚乙二醇
‑
Y通过点击化学反应得到用于病灶原位形成水凝胶支架的聚合物，所述聚合物还负载有纳米/微米粒子和生长因子，所述纳米/微米颗粒负载有免疫调控药物和/或抗氧化药物、和/或DNA、RNA、多肽、蛋白质或外泌体生物大分子；
[0005]所述X修饰过的天然分子与多臂聚乙二醇
‑
Y进行点击化学反应的官能团对X与Y选自巯基与马来酰胺基、巯基与烯、叠氮与炔环、共轭双烯与取代烯烃、醛与酰肼、四嗪与降冰片烯、或四嗪与异腈；
[0006]所述多臂聚乙二醇
‑
Y，为2
‑
臂聚乙二醇
‑
Y、3
‑
臂聚乙二醇
‑
Y或3
‑
臂聚乙二醇
‑
Y；
[0007]所述多臂聚乙二醇
‑
Y中聚乙二醇的聚合度n为1
‑
1000；
[0008]所述天然分子为明胶、胶原蛋白、透明质酸或其钠盐或海藻酸钠。
[0009]作为优选方案，所述纳米/微米粒子选自反应基团修饰过的高分子微米/纳米粒子和/或脂质体中一种或多种的混合。
[0010]作为优选方案，所述纳米/微米粒子采用聚乙烯、聚乳酸或脂质体粒子中的一种或多种的混合。
[0011]作为优选方案，所述免疫调控类和/或抗氧化类药物为甲基强的松龙(MP)、甲基泼尼松龙琥珀酸钠(MPSS)、异丙嗪、地塞米松、氢化可的松、布洛芬、羟基保泰松、环孢菌素A、藤霉素、硫唑嘌呤、6
‑
巯基嘌呤、环磷酰胺、他克莫司(KF506)、雷帕霉素、霉酚酸脂、茶多酚(TP)、生育酚、丁基羟基茴香醚(BHA)、二丁基羟基甲苯(BHT)、叔丁基对苯二酚(TBHQ)、DNA、RNA、多肽、蛋白质、外泌体生物大分子中一种或多种的混合。
[0012]作为优选方案，所述细胞生长因子为碱性成纤维生长因子(bFGF)、脑源性神经营养因子 (BDNF)、血管内皮生长因子(VEGF)、酸性成纤维生长因子(aFGF)、肝细胞生长因子(HGF)、睫状神经营养因子(CNTF)、胶质细胞衍生神经营养因子(GDNF)、神经营养因子
‑
3(NT
‑
3)、表皮生长因子(EGF)、白介素3(IL
‑
3)、转化生长因子
‑
α(TGF
‑
α)、转化生长因子
‑
β(TGF
‑
β)、血小板衍生的生长因子(PDGF)、胰岛素样生长因子
‑
1(IGF
‑
1)、骨形态发生蛋白(BMP)、结缔组织生长因子(CTGF)、骨桥蛋白(OPN)、生长激素释放因子(GRF)中一种或多种的混合。
[0013]本专利技术还提供了一种上述治疗软组织损伤的可注射水凝胶细胞支架材料的制备方法，包括以下步骤：
[0014]步骤1：氨基化明胶(Gelatin
‑
NH2)的合成：
[0015](1)称量明胶和去离子，并加入盐酸调节pH至5.0～5.3，并在40
±
10℃下搅拌约1小时至明胶完全溶解，得到质量浓度为10～50g/L的明胶溶液；(2)加入100～200ml/L的乙二胺，并用盐酸调节pH至5.0～5.3；(3)继续立即加入15～25g/L的EDC，并缓慢搅拌反应 24h以上后，混合物转移至透析袋，去离子水中避光透析48h小时以上去除杂质；(4)得到的产物经过冻干，得到白色絮状产物Gelatin
‑
NH2，并置于低温保存；
[0016]步骤2：巯基化明胶(Gelatin
‑
SH)的合成：
[0017](1)称量Gelatin
‑
NH2溶于去离子水得到浓度为10～30g/L的Gelatin
‑
NH2溶液并调节pH至7.0～7.3；(2)然后加入微过量的2
‑
亚氨基硫杂环戊烷盐酸盐，避光缓慢搅拌反应3h 以上；(3)得到反应混合物转移至透析袋，并经过盐酸和去离子水透析去除杂质；(4)得到的产物经过冻干，得到白色絮状产物Gelatin
‑
SH，并置于低温保存；
[0018]步骤3：负载甲基强的松龙的马来酰胺化的脂质体纳米粒子的合成：
[0019](1)将(2,3
‑
二油氧基丙基)三甲基氯化铵(DOTAP)、胆固醇、DSPE
‑
PEG(2K)
ꢀ‑
Maleimide、DSPE
‑
PEG分别配制成5mg/mL的氯仿溶液，并按体积比为 1000:80～120:30～60:30～60的比例混合均匀；(2)然后继续加入甲泼尼龙混合均匀；(3)接着在45
±
5℃、
‑
0.1MPa气压的条件下旋转蒸发1
‑
2小时，形成均匀薄膜并充分去除氯仿；(4) 随后向薄膜中加入去离子水，超声水化30min至薄膜完全脱落，得到乳白色溶液；(5)接着通过脂质体挤出器将超声后的水化液依次通过0.4μm、0.2μm、0.1μm的滤膜，每个层级推挤15
‑
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种治疗软组织损伤的可注射水凝胶细胞支架材料，其特征在于：以X基团修饰过的天然分子与多臂聚乙二醇
‑
Y通过点击化学反应得到用于病灶原位形成水凝胶支架的聚合物，所述聚合物还负载有纳米/微米粒子和生长因子，所述纳米/微米颗粒负载有免疫调控药物和/或抗氧化药物、和/或DNA、RNA、多肽、蛋白质或外泌体生物大分子；所述X修饰过的天然分子与多臂聚乙二醇
‑
Y进行点击化学反应的官能团对X与Y选自巯基与马来酰胺基、巯基与烯、叠氮与炔环、共轭双烯与取代烯烃、醛与酰肼、四嗪与降冰片烯、或四嗪与异腈；所述多臂聚乙二醇
‑
Y，为2
‑
臂聚乙二醇
‑
Y、3
‑
臂聚乙二醇
‑
Y或3
‑
臂聚乙二醇
‑
Y；所述多臂聚乙二醇
‑
Y中聚乙二醇的聚合度n为1
‑
1000；所述天然分子为明胶、胶原蛋白、透明质酸或其钠盐或海藻酸钠。2.根据权利要求1所述治疗软组织损伤的可注射水凝胶细胞支架材料，其特征在于：所述纳米/微米粒子选自反应基团修饰过的高分子微米/纳米粒子和/或脂质体中一种或多种的混合。3.根据权利要求2所述治疗软组织损伤的可注射水凝胶细胞支架材料，其特征在于：所述纳米/微米粒子采用聚乙烯、聚乳酸或脂质体粒子中的一种或多种的混合。4.根据权利要求1所述治疗软组织损伤的可注射水凝胶细胞支架材料，其特征在于：所述免疫调控类和/或抗氧化类药物为甲基强的松龙(MP)、甲基泼尼松龙琥珀酸钠(MPSS)、异丙嗪、地塞米松、氢化可的松、布洛芬、羟基保泰松、环孢菌素A、藤霉素、硫唑嘌呤、6
‑
巯基嘌呤、环磷酰胺、他克莫司(KF506)、雷帕霉素、霉酚酸脂、茶多酚(TP)、生育酚、丁基羟基茴香醚(BHA)、二丁基羟基甲苯(BHT)、叔丁基对苯二酚(TBHQ)、DNA，RNA、多肽、蛋白质、外泌体生物大分子中一种或多种的混合。5.根据权利要求1所述治疗软组织损伤的可注射水凝胶细胞支架材料，其特征在于：所述细胞生长因子为碱性成纤维生长因子(bFGF)、脑源性神经营养因子(BDNF)、血管内皮生长因子(VEGF)、酸性成纤维生长因子(aFGF)、肝细胞生长因子(HGF)、睫状神经营养因子(CNTF)、胶质细胞衍生神经营养因子(GDNF)、神经营养因子
‑
3(NT
‑
3)、表皮生长因子(EGF)、白介素3(IL
‑
3)、转化生长因子
‑
α(TGF
‑
α)、转化生长因子
‑
β(TGF
‑
β)、血小板衍生的生长因子(PDGF)、胰岛素样生长因子
‑
1(IGF
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1)、骨形态发生蛋白(BMP)、结缔组织生长因子(CTGF)、骨桥蛋白(OPN)、生长激素释放因子(GRF)中一种或多种的混合。6.一种权利要求1～5任一所述治疗软组织损伤的可注射水凝胶细胞支架材料的制备方法，包括以下步骤：步骤1：氨基化明胶(Gelatin
‑
NH2)的合成：(1)称量明胶和去离子，并加入盐酸调节pH至5.0～5.3，并在40
±
10℃下搅拌约1小时至明胶完全溶解，得到质量浓度为10～50g/L的明胶溶液；(2)加入100～200ml/L的乙二胺，并用盐酸...

【专利技术属性】
技术研发人员：王绪化，陈作兵，陈向峰，左彦明，叶婧佳，靳爽，吴中翰，蔡万雄，张天芳，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：