核苷酸的正交去封闭制造技术

提供了核苷酸的正交去封闭。包括以下步骤的方法：(a)提供位点阵列，其中每个位点包含不同核酸模板的混合物；(b)分别用含有不同可逆封闭部分的不同核苷酸类似物延伸在每个所述位点处与所述不同核酸模板杂交的引物，从而在每个位点处产生不同的引物延伸产物；(c)检测所述不同的引物延伸产物，以区分每个位点处的所述不同的核苷酸类似物；和(d)在每个所述位点处，使用对第一不同可逆封闭部分选择性的第一处理和对第二不同可逆封闭部分选择性的第二处理来从所述引物延伸产物除去所述不同可逆封闭部分。逆封闭部分。逆封闭部分。

【技术实现步骤摘要】
核苷酸的正交去封闭
[0001]本申请是申请日为2016年7月8日，申请号：201680036416.6，专利技术名称为“核苷酸的正交去封闭”的中国专利技术专利申请的分案申请。

技术介绍

[0002]本公开一般涉及核酸分析，并且更具体地涉及核酸测序。
[0003]目前可用于对DNA测序的商业平台相对昂贵。这些平台使用所谓的“合成测序”方法，因为DNA聚合物是在检测添加到生长中的聚合物结构的每种单体(即核苷酸)的同时合成的。由于模板DNA链严格指导新DNA聚合物的合成，可以从在合成中添加到生长的链的一系列核苷酸单体来推测DNA模板的序列。通过通常在生物系统中进行DNA合成的生化组分的特殊工程化变体来促进检测单体添加的能力。这些工程化的成分制造相对昂贵，并且在合成测序期间相对大量消耗。此外，监测反应使用相对昂贵的硬件，例如激光器、检测光学器件(optics)和复杂的流体递送系统。即便在可以开始合成测序之前，迄今为止最成功的商业平台也需要昂贵的试剂和硬件来扩增DNA模板。这些平台的复杂性和成本已经阻碍了它们在对技术有明确需求的临床和研究环境中的使用。
[0004]因此，需要对边合成边测试平台进行改进，使其更具成本效益、快速和便捷。本公开解决了这种需要并且还提供了其它优点。

技术实现思路

[0005]本公开提供了用于鉴定核酸模板的方法。所述方法可以包括以下步骤：(a)提供位点阵列，其中每个位点包含至少两种不同核酸模板的混合物；(b)分别用含有不同可逆封闭部分的不同核苷酸类似物延伸在每个所述位点处与所述不同核酸模板杂交的引物，从而在每个位点处产生不同的引物延伸产物；(c)检测所述不同的引物延伸产物，以区分每个位点处的所述不同的核苷酸类似物；和(d)在每个所述位点处，使用对第一不同可逆封闭部分选择性的第一处理和对第二不同可逆封闭部分选择性的第二处理来从所述引物延伸产物除去所述不同可逆封闭部分。任选地，所述方法还包括(e)重复(b)至(d)以测定在每个位点处添加到每个所述不同延伸产物的不同核苷酸类似物的序列。
[0006]还提供了用于对核酸模板测序的方法，其可以包括以下步骤：(a)提供位点阵列，其中每个位点包含第一核酸模板和第二核酸模板，其中所述第一核酸模板具有与第二核酸模板的序列不同的序列，其中将第一引物与第一核酸模板结合，并且其中将第二引物与第二核酸模板结合，可逆封闭部分是附接至所述第二引物的；(b)通过添加附接至可逆封闭部分的第一核苷酸类似物来延伸所述第一引物，其中附接至第一核苷酸的可逆封闭部分与附接至第二引物的所述可逆封闭部分不同；(c)选择性除去附接至所述第二引物的可逆封闭部分，而保留附接至添加到第一引物的核苷酸类似物的可逆封闭部分；(d)通过添加附接至可逆封闭部分的第二核苷酸类似物来延伸所述第二引物，其中附接至所述第一核苷酸类似物的所述可逆封闭部分与附接至所述第二核苷酸类似物的所述可逆封闭部分不同；以及(e)在每个位点处检测添加到第一引物的核苷酸类似物和添加到第二引物的核苷酸类似
物，从而在每个位点处测定第一模板和第二模板的不同序列。任选地，所述方法还可以包括步骤(f)选择性除去附接至添加到第一引物的第一核苷酸类似物的可逆封闭部分，而保留附接至添加到第二引物的第二核苷酸类似物的可逆封闭部分；(g)在(f)后，通过添加附接至可逆封闭部分的第三核苷酸类似物来延伸所述第一引物；(h)选择性除去附接至添加到第二引物的第二核苷酸类似物的可逆封闭部分，而保留附接至添加到第一引物的第一核苷酸类似物的可逆封闭部分；(i)在(h)后，通过添加附接至可逆封闭部分的第四核苷酸类似物来延伸所述第二引物，其中附接至所述第三核苷酸类似物的所述可逆封闭部分与附接至所述第四核苷酸类似物的所述可逆封闭部分不同；以及(h)在每个位点处，检测添加到(g)中所述第一引物的核苷酸类似物和添加到(i)中所述第二引物的核苷酸类似物，从而在每个位点处测定第一模板和所述第二模板的不同序列。任选地，可以重复步骤(f)至(h)。
[0007]还提供的是用于对核酸模板测序的方法，其可以包括以下步骤：(a)提供位点阵列，其中每个位点包含第一核酸模板和第二核酸模板，其中所述第一核酸模板具有与所述第二核酸模板的序列不同的序列，其中将第一引物与所述第一核酸模板结合，可逆封闭部分是附接至所述第一引物的，其中将第二引物与所述第二核酸模板结合，可逆封闭部分是附接至所述第二引物的，并且其中附接至所述第一引物的所述可逆封闭部分与附接至所述第二引物的所述可逆封闭部分不同；(b)选择性除去附接至所述第一引物的可逆封闭部分，而保留附接至所述第二引物的可逆封闭部分；(c)通过添加附接至可逆封闭部分的第一核苷酸类似物来延伸所述第一引物；(d)选择性除去附接至所述第二引物的所述可逆封闭部分，而保留附接至添加到所述第一引物的所述核苷酸类似物的所述可逆封闭部分；(e)通过添加附接至可逆封闭部分的第二核苷酸类似物来延伸所述第二引物，其中附接至所述第一核苷酸类似物的所述可逆封闭部分与附接至所述第二核苷酸类似物的所述可逆封闭部分不同；以及(f)在每个所述位点处检测添加到所述第一引物的所述核苷酸类似物和添加到所述第二引物的所述核苷酸类似物，从而在每个所述位点处测定所述第一模板和所述第二模板的不同序列。
[0008]本公开还提供了核酸阵列，其包含固体支持物上的多个位点，其中每个位点包含第一核酸模板和第二核酸模板，其中所述第一核酸模板具有的序列不同于所述第二核酸模板的序列，其中第一引物结合至所述第一核酸模板，第一可逆封闭部分附接至所述第一引物，其中第二引物结合至所述第二核酸模板，第二可逆封闭部分附接至所述第二引物，和其中所述第一可逆封闭部分与所述第二可逆封闭部分是不同的。
附图说明
[0009]图1显示了在阵列的位点处对两个模板的混合物同时进行的合成测序的循环图，其中同时切割存在于相同延伸产物上的标记物部分和去封闭部分的子集(subset)。
[0010]图2显示了在阵列的位点处对两个模板的混合物同时进行的合成测序的循环图，其中同时切割存在于不同延伸产物(即在R1和R2反应两者中所产生)上的标记物部分。
具体实施方式
[0011]本公开提供了用于核酸的高密度检测的方法。本公开方法的具体实施方案利用已知技术来操作和检测核酸。然而，如下列出的改进提供了正交处理使得增加了使用这些技
术获得的信息密度。
[0012]基于引物延伸的检测技术的例子说明可以获得的增加的信息密度。具体而言，可将核酸的靶序列与引物杂交，并通过DNA聚合酶延伸引物以添加标记的核苷酸类似物。可以使用具有多个位点的阵列形式，每个位点具有与在其它位点处存在的靶序列不同的单一靶序列。任选地，也可以使用数种不同的核苷酸类似物种类，每种具有可区分的标记物。引物延伸导致将标记的核苷酸类似物募集到具有靶序列的核酸。在使用不同标记的核苷酸类似物的阵列形式中，可以区分募集到每个位点处的标记物，并使用该信息来识别所述位点处的靶核酸。从该阵列形式获得的信息密度为每个位点处识别的一个目标序列。
[0013]在本本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.用于对核酸模板测序的方法，其包括以下步骤：(a)提供位点阵列，其中每个位点包含第一核酸模板和第二核酸模板，其中所述第一核酸模板具有与第二核酸模板的序列不同的序列，其中将第一引物与第一核酸模板结合，并且其中将第二引物与第二核酸模板结合，可逆封闭部分是附接至所述第二引物的；(b)通过添加附接至可逆封闭部分的第一核苷酸类似物来延伸所述第一引物，其中附接至第一核苷酸的可逆封闭部分与附接至第二引物的所述可逆封闭部分不同；(c)选择性除去附接至所述第二引物的可逆封闭部分，而保留附接至添加到第一引物的核苷酸类似物的可逆封闭部分；(d)通过添加附接至可逆封闭部分的第二核苷酸类似物来延伸所述第二引物，其中附接至所述第一核苷酸类似物的所述可逆封闭部分与附接至所述第二核苷酸类似物的所述可逆封闭部分不同；以及(e)在每个位点处检测添加到第一引物的核苷酸类似物和添加到第二引物的核苷酸类似物，从而在每个位点处测定第一模板和第二模板的不同序列。2.权利要求1的方法，其还包括以下步骤：(f)选择性除去附接至添加到第一引物的第一核苷酸类似物的可逆封闭部分，而保留附接至添加到第二引物的第二核苷酸类似物的可逆封闭部分；(g)在(f)后，通过添加附接至可逆封闭部分的第三核苷酸类似物来延伸所述第一引物；(h)选择性除去附接至添加到第二引物的第二核苷酸类似物的可逆封闭部分，而保留附接至添加到第一引物的第一核苷酸类似物的可逆封闭部分；(i)在(h)后，通过添加附接至可逆封闭部分的第四核苷酸类似物来延伸所述第二引物，其中附接至所述第三核苷酸类似物的所述可逆封闭部分与附接至所述第四核苷酸类似物的所述可逆封闭部分不同；以及(h)在每个位点处，检测添加到(g)中所述第一引物的核苷酸类似物和添加到(i)中所述第二引物的核苷酸类似物，从而在每个位点处测定第一模板和所述第二模板的不同序列。3.权利要求2的方法，其中步骤(f)至(h)能进行重复。4.权利要求1
‑
3中任一项的方法，其中所述检测使用具有空间分辨率的检测器，所述空间分辨率太低而不能解析与在每个所述位点处所述第一引物和所述第二引物之间的间隔等同的距离处的点。5.权利要求1
‑
4中任一项的方法，其中所述检测器是光学检测器。6.权利要求1
‑
5中任一项的方法，其中所述核苷酸类似物包含光学标记物。7.权利要求6的方法，其中所述第一核苷酸类似物来自第一组核苷酸类似物，其中所述第二核苷酸类似物来自第二组核苷酸类似物，并且其中所述第一组核苷酸类似物的所述光学标记物与所述第二组核苷酸类似物的光学标记物不同。8.权利要求1
‑
7中任一项的方法，其中所述第一核苷酸类似物来自第一组核苷酸类似物，其中所述第二核苷酸类似物来自第二组核苷酸类似物，并且其中所述第一组核苷酸类似物中所述核苷酸类似物的亚组包含光学标记物。9.权利要求8的方法，其中所述第二组核苷酸类似物中所述核苷酸类似物的亚组包含
光学标记物。10.权利要求9的方法，其中所述第一组核苷酸类似物中核苷酸类似物的亚组包含光学标记物，所述光学标记物与所述第二组核苷酸类似物中所述核苷酸的亚组的所述光学标记物不同。11.权利要求1
‑
7中任一项的方法，其中所述第一核苷酸类似物来自第一组核苷酸类似物，其中所述第二核苷酸类似物来自第二组核苷酸类似物，其中所述第一组核苷酸类似物仅包含在步骤(e)中检测的一类光学标记物，并且所述第二组核苷酸类似物仅包含在步骤(e)中检测的一类光学标记物。12.权利要求11的方法，其中将所述一类光学标记物附接至所述第一组中第一种类的基本上所有的核苷酸类似物，将所述一类光学标记物附接至所述第一组中第二种类的所述核苷酸类似物的亚组，将所述第一组中第三种类的基本上所有的核苷酸类似物附接至配体，以及不将所述第一组中第四种类的基本上所有的核苷酸类似物附接至所述一类光学标记物或所述配体。13.权利要求1
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7中任一项的方法，其中所述第一核苷酸类似物来自第一组核苷酸类似物，其中所述第二核苷酸类似物来自第二组核苷酸类似物，其中所述第一组核苷酸类似物仅包含在步骤(e)中检测的两类光学标记物，并且所述第二组核苷酸类似物仅包含在步骤(e)中检测的两类光学标记物。14.权利要求13的方法，其中仅将所述两类光学标记物之一附接至所述第一组中的第一种类的基本上所有核苷酸类似物，仅将所述两类光学标记物中的第二种附接至所述第一组中的第二种类的基本上所有核苷酸类似物，将所述两类光学标记物之一和所述两类光学标记物中的第二种附接至所述第一组中第三种类的核苷酸类似物，和不将所述第一组中的第四种类的基本上所有的核苷酸类似物附接至所述两类光学标记物之一或所述两类光学标记物中的所述第二种。15.权利要求1
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14中任一项的方法，其中所述检测器的像素同时获取来自所述第一引物和所述第二引物两者的信号。16.权利要求1
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15中任一项的方法，其中所述第一核酸模板包含至少一个碱基部分，所述碱基部分与所述第二核酸模板中的碱基部分是相同种类。17.权利要求1

【专利技术属性】
技术研发人员：EH特雷帕格尼尔，T库拉纳，
申请(专利权)人：亿明达股份有限公司，
类型：发明
国别省市：