预测复发性流产人群孕期凝血功能异常的方法技术

本发明专利技术公开了一种预测复发性流产人群孕期凝血功能异常的方法，应用差速离心法对URSA患者血浆中的血小板进行分离，然后使用DNA限制性内切酶对血小板沉淀进行核基因组DNA干扰的处理消化，然后直接对消化产物进行重亚硫酸盐处理，并结合焦磷酸测序法检测血小板mtDNA中呼吸链相关基因位点包括MT

【技术实现步骤摘要】
预测复发性流产人群孕期凝血功能异常的方法


[0001]本专利技术涉及一种预测复发性流产人群孕期凝血功能异常的方法，具体地说是一种利用表观遗传学标志物预测复发性流产人群孕期凝血功能异常的方法，属于遗传学领域。

技术介绍

[0002]自然流产占全部妊娠的发生率的15%
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40%，连续2次或2次以上的自然流产称为复发性自然流产（RSA）, 引起RSA的因素复杂多样，主要包括遗传因素、感染因素、内分泌因素、解剖因素、免疫因素及凝血因素等。其中有40%~50%的患者流产原因未明，称为不明原因复发性流产（URSA）。凝血功能异常被认为是导致RSA主要原因。研究显示，在不良妊娠结局的患者中，有近55%
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62%患者表现出凝血功能异常，通常表现为血液高凝状态，血栓形成风险增加等。凝血功能可影响全身、胎盘血液循环状态，当凝血功能指标超过正常生理范围时，可导致胎盘缺血、缺氧，提高流产、胎儿窘迫等发生率，影响妊娠安全性和妊娠结局。血浆中的D
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二聚体（D
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Dimer）、蛋白S（PS）、蛋白C（PC）和血同型半胱氨酸（HCY）水平是由凝血功能异常引起的RSA独立危险因素和干预治疗的靶点和目标。近年来，在多种凝血因素的相互影响下， RSA的概率逐年上升， RSA概率的增高对女性妊娠有不利影响。因此，需要尽早采取有效方式进行诊断以明确引起RSA的凝血因素，同时应密切监测凝血功能相关指标，必要时加以干预，以维持凝血功能正常，避免RSA的发生，已经成为当今社会的急切需求。r/>[0003]凝血因素导致的URSA多在临床中难以明确其具体发病机制，通常是多个基因之间或多个基因与环境因素之间长期相互作用的结果。线粒体在维持细胞内能量稳态中发挥重要作用，并参与氧化磷酸化、活性氧ROS调节、钙离子动态平衡以及信号转导等多种重要生物过程。血小板凝血功能与血小板线粒体存在密切关系。因此，分析血小板线粒体DNA（mtDNA）关键位点的甲基化水平与URSA人群中凝血功能异常的关联，明确对凝血功能异常发生风险有预测作用的血小板mtDNA中的敏感CpG位点，并以此作为潜在生物标志物，将有助于孕期凝血功能异常事件的发病风险预测、诊断和个体化治疗。但是到目前为止，还未发现有相关的人群研究和探索，并缺乏相应的人群研究数据。因此亟需确定URSA人群中凝血功能异常的CpG位点和甲基化水平。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的在于，设计了一种预测复发性流产人群孕期凝血功能异常的方法，通过选择与URSA相关的线粒体位点进行甲基化水平检测，利用AUC评估生物标志物的诊断效能，提高了对凝血功能异常发病风险的预测能力。
[0005]本专利技术的技术方案为：预测复发性流产人群孕期凝血功能异常的方法，包括以下步骤：步骤（1）：应用差速离心法对URSA患者血浆中的血小板进行分离，然后使用DNA限制性内切酶对血小板沉淀进行核基因组DNA干扰的处理消化，然后直接对消化产物进行重亚硫酸盐处理，并结合焦磷酸测序法检测血小板mtDNA中呼吸链相关基因位点包括MT
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ATP8、MT
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COX1、MT
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COX2、MT
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COX3、MT
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ND5、MT
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TRNA的甲基化水平；其中，焦磷酸测序法作为一种新的序列分析方法，能够快速地检测甲基化的频率，对样品中的甲基化位点进行精确的定性及定量检测。
[0006]本专利技术通过准确定量单个连续的CpG位点上的甲基化频率，焦磷酸测序本身能检测并定量甲基化水平上的细微改变。在序列延伸过程中，根据C和T的掺入量来定量确定单个位点的C
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T 比例。因此，不同CpG位点的甲基化率变化就能被准确检测。由于焦磷酸测序提供了真实的序列数据，甲基化状态便可以序列形式呈现。使用logistic回归分析评估血小板mtDNA单个位点与凝血功能异常发病风险的关系并计算危险甲基化位点的相对危险度OR，利用ROC曲线下面积AUC对血小板mtDNA位点的甲基化水平与凝血功能异常的关系进行预测。结合传统风险因素，并根据单个位点或多个联合位点结果建立预测模型分组，筛选出能较准确预测孕期凝血功能异常的血小板mtDNA位点。
[0007]另外，URSA风险人群的纳入标准为：（1）既往有2次/2次以上妊娠28周前的胎儿丢失史；（2）夫妇双方外周血染色体核型正常；（3）经妇科、B超、宫腔镜及子宫输卵管造影等确诊无生殖器管解剖学畸形；（4）内分泌功能无异常，包括月经周期正常、排卵正常、甲状腺功能正常、无糖尿病、多囊卵巢综合征；（5）磷脂抗体谱、抗核抗体谱、狼疮抗凝物检测正常，甲状腺抗体阴性；（6）血栓前状态检测包括凝血功能、同型半胱氨酸、蛋白C/S无异常；（7）生殖道感染相关病原微生物检测为阴性，无生殖道病变及感染；（8）无心脏、肝脏及肾脏急、慢性疾病，无传染病。
[0008]进一步的，凝血功能异常指标的测量方法为：利用真空采血针静脉穿刺采集静脉血，测定D
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Dimer、PS、PC、HCY水平。
[0009]进一步的，采用全自动凝血分析仪测定D
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Dimer、PS、PC、HCY水平。凝血功能异常的诊断标准为：D
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二聚体即D
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Dimer≥500 ug/L和/或孕前蛋白S即PS＜55％和/或蛋白C即PC＜87％或PC＞133％和/或血同型半胱氨酸即HCY≥10umol/L。
[0010]步骤（2）血小板mtDNA位点选择和预测模型分组：选择与孕期凝血功能异常包括D
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Dimer、PS、PC、HCY相关的血小板mtDNA位点，分别为ATP8、COX1、COX2、COX3、ND5、TRNA的位点一、位点二及其位点的平均甲基化水平，首先利用焦磷酸测序法检测相应位点的甲基化水平；然后利用ROC曲线下面积AUC得出血小板mtDNA单个位点或者多个联合位点对孕期凝血功能异常的预测效果，根据预测效能的准确程度并考虑其经济成本，结合传统风险因素建立凝血功能异常预测模型分组；步骤（3）统计：使用logistic回归分析评估血小板mtDNA单个位点与孕期凝血功能异常事件发生的相关性，并利用ROC曲线下面积AUC，结合传统风险因素建立预测模型分组，以评估不同血小板mtDNA位点对凝血功能异常预测的准确性。
[0011]早期识别孕期凝血功能异常高危人群，并采取针对性的治疗措施，是减少URSA发生，获得健康妊娠结局的关键。危险预测可为疾病预防、政府决策和卫生干预方案效果评价，以及临床治疗提供可参考的信息。ROC曲线下面积（AUC）是评估预测效果准确性的综合评价指标之一，具有较为准确的预测效能。使用AUC对线粒体位点的甲基化水平进行预测，以判断血小板mtDNA中的相关位点的甲基化水平是否可以作为预测孕期凝血功能异常的标志物。将表观遗传学技术与流行病学方法相结合，评估个体患病风险，并据此采取更早或更强的干预措施，使患者从本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.预测复发性流产人群孕期凝血功能异常的方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤（1）：应用差速离心法对URSA患者血浆中的血小板进行分离，然后使用DNA限制性内切酶对血小板沉淀进行核基因组DNA干扰的处理消化，然后直接对消化产物进行重亚硫酸盐处理，并结合焦磷酸测序法检测血小板mtDNA中呼吸链相关基因位点包括MT
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ATP8、MT
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COX1、MT
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COX2、MT
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COX3、MT
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ND5、MT
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TRNA的甲基化水平；步骤（2）血小板mtDNA位点选择和预测模型分组：选择与孕期凝血功能异常包括D
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Dimer、PS、PC、HCY相关的血小板mtDNA位点，分别为ATP8、COX1、COX2、COX3、ND5、TRNA的位点一、位点二及其位点的平均甲基化水平，首先利用焦磷酸测序法检测相应位点的甲基化水平；然后利用ROC曲线下面积AUC得出血小板mtDNA单个位点或者多个联合位点对孕期凝血功能异常的预测效果，根据预测效能的准确程度并考虑其经济成本，结合传统风险因素建立凝血功能异常预测模型分组；步骤（3）统计：使用logistic回归分析评估血小板mtDNA单个位点与孕期凝血功能异常事件发生的相关性，并利用ROC曲线下面积AUC，结合传统风险因素建立预测模型分组，以评估不同血小板mtDNA位点对凝血功能异常预测的准确性。2.根据权利要求1所述的预测复发性流产人群孕期凝血...

【专利技术属性】
技术研发人员：郭丽琼，张颖，刘子泉，刘琪思婧，于媛媛，
申请(专利权)人：天津大学温州安全应急研究院，
类型：发明
国别省市：