一种单细胞转录组测序的方法技术

本发明专利技术提供了一种单细胞转录组测序的方法。具体地，本发明专利技术的方法采用“一管法”，将样品裂解、逆转录、PCR扩增以及产物纯化步骤在同一个反应容器内完成，提高了对细胞转录组中低丰度RNA以及特殊结构中的RNA扩增的灵敏度，减少了转录组信息的丢失，提高了单细胞转录组扩增和测序效率。并且，本发明专利技术的方法同时适用于固定的单细胞样本和活的新鲜单细胞样本的转录组测序。本发明专利技术还提供了一种用于单细胞转录组测序的试剂盒以及一种单细胞转录组测序装置，实现了对单细胞转录组更加简便快捷、灵敏完整的测序。的测序。

【技术实现步骤摘要】
一种单细胞转录组测序的方法


[0001]本专利技术涉及生物
，具体地，本专利技术涉及一种单细胞转录组测序的方法。

技术介绍

[0002]单细胞转录组测序技术是在单细胞水平对转录组进行扩增与测序的一项新技术。其原理是将分离的单个细胞的微量转录组RNA进行扩增后进行高通量测序。目前市场上被广泛使用的单细胞转录组测序方法为HT Kit和10XGenomics单细胞转录组测序平台。采用HT Kit可以从单个细胞中获得全长的cDNA，并进行下游的扩增，建库测序，但是通量很小，价格昂贵。而10XGenomics单细胞转录组测序平台一次可以对上万个细胞进行单细胞转录组测序，但是这种方法的原理使得只能获得转录组3'端信息。而且上述两种方法都只能针对新鲜的活的单细胞进行单细胞转录组测序。
[0003]在研究过程中，常常会碰到目标细胞在整个单细胞悬液中的比列很低的情况，需要花费较长时间进行筛选，在这个过程中会导致单细胞的活性减弱，转录本发生变化，如果能够在筛选前将细胞进行固定，使得转录本不再发生改变，将留给实验者更多的时间进行细胞筛选，同时获得更准确的单细胞转录本信息。
[0004]目前已发表的研究成果例如Elliot R Thomsen等人，Nat Methods.2016；13(1)：87
‑
93和Johannes W Bagnoli等人，Nat Commun.2018；9(1)：2937表明固定的单细胞样本也可以进行单细胞转录组文库的构建，并进行后续的建库测序。但是在Elliot R Thomsen等人，Nat Methods.2016；13(1)：87
‑
93中提到的针对固定单细胞样本进行转录组扩增的过程中需要对释放出mRNA进行纯化，而在Johannes W Bagnoli等人，Nat Commun.2018；9(1)：2937中提到的针对固定单细胞样本进行转录组扩增的过程中需要对逆转录产物进行纯化，针对微量的mRNA和cDNA的纯化会造成低丰度转录本信息的丢失。
[0005]因此,本领域迫切需要开发一种新的单细胞转录组测序方法。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的就是提供了一种单细胞转录组扩增、建库和测序的方法。
[0007]本专利技术的第一方面，提供了一种单细胞转录组测序方法，所述方法主要包括以下步骤：
[0008](a)提供单细胞样品并置于一反应容器中；
[0009](b)使用含有蛋白酶K的缓冲液对样品进行裂解(即解交联)，从而裂解产物；
[0010](c)以所述裂解产物为模板，进行逆转录反应，从而得到含cDNA的逆转录产物；
[0011](d)对所述的逆转录产物进行PCR扩增，从而获得扩增产物；
[0012](e)对所述的扩增产物进行纯化，从而获得经纯化的扩增产物；和
[0013](f)对所述经纯化的扩增产物进行建库和测序，从而获得单细胞转录组测序数据；
[0014]其中，在步骤(b)、(c)和(d)各步骤以及其间均不包括核酸纯化操作；
[0015]并且，在步骤(b)、(c)和(d)均在同一反应容器中进行。
[0016]在另一优选例中，所述的步骤(e)也在同一反应容器中进行。
[0017]在另一优选例中，所述的单细胞是新鲜的单细胞或固定后的单细胞。
[0018]在另一优选例中，所述的单细胞选自人肾胚细胞、神经元细胞或其他类型细胞。
[0019]在另一优选例中，在步骤(b)中，蛋白酶K的用量为0.2
‑
1.5mg/ml(μg/μl),即(0.4
‑
4.5μg)蛋白酶K/(2
‑
3μl)裂解反应体积。
[0020]在另一优选例中，在步骤(b)中，所述缓冲液为TE缓冲液。
[0021]在另一优选例中，所述TE缓冲液包括以下组分：10mM Tris
·
HCl和1mM EDTA和溶剂(例如水)。
[0022]在另一优选例中，所述TE缓冲液的pH值为7.0
‑
8.8，较佳地约8.0。
[0023]在另一优选例中，步骤(b)中裂解(解交联)的反应温度为50
‑
70℃，较佳地55
‑
65℃，最佳地约56℃。
[0024]在另一优选例中，步骤(b)中裂解(解交联)的反应时间为10分钟
‑
3小时，较佳地0.25
‑
2小时，较佳地0.5
‑
1.5小时，最佳地约1小时。
[0025]在另一优选例中，所述的裂解产物含有释放出的RNA。
[0026]在另一优选例中，在步骤(b)和(c)之间还包括：对裂解产物进行灭活处理，从而使得蛋白酶K失活。
[0027]在另一优选例中，所述的灭活处理包括95
±
3℃加热处理一段时间(如5
‑
30分钟)。
[0028]在另一优选例中，在步骤(c)中所述的逆转录反应的反应体系中含有大分子聚乙二醇，所述大分子聚乙二醇选自下组：PEG6000、PEG7000、PEG8000、PEG9000或其组合。
[0029]在另一优选例中，在步骤(c)中所述的逆转录反应的反应体系中含有PEG8000。
[0030]在另一优选例中，所述PEG8000在反应体系中的终浓度为6
‑
10％(v/v)，优选地为7.5％。
[0031]在另一优选例中，所述的反应体系中还包括TSO引物、oligo
‑
dT引物、以及逆转录反应所需的其它必要试剂。
[0032]在另一优选例中，所述TSO引物的3'末端含有rGrG+G修饰。
[0033]在另一优选例中，所述oligo
‑
dT引物的3'末端含有poly T修饰。
[0034]在另一优选例中,所述逆转录反应所需的其他必要试剂包括逆转录酶、反应缓冲液、还原剂(例如DTT)、和RNA酶抑制剂。
[0035]在另一优选例中，所述裂解或步骤(b)在体积为V1的第一反应体系进行。
[0036]在另一优选例中，所述逆转录或步骤(c)在体积为V2的第二反应体系进行。
[0037]在另一优选例中，所述PCR反应或步骤(d)在体积为V3的第三反应体系进行。
[0038]在另一优选例中，V1＜V2＜V3。
[0039]在另一优选例中，V2/V1＝1.5
‑
4,较佳地2
‑
3。
[0040]在另一优选例中，V3/V2＝1.5
‑
4,较佳地2
‑
3。
[0041]在另一优选例中，所述的V1为2
‑
5微升。
[0042]在另一优选例中，所述的V2为5
‑
15微升。
[0043]在另一优选例中，所述的V3为15
‑...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种单细胞转录组测序方法，其特征在于，所述方法主要包括以下步骤：(a)提供单细胞样品并置于一反应容器中；(b)使用含有蛋白酶K的缓冲液对样品进行裂解(即解交联)，从而裂解产物；(c)以所述裂解产物为模板，进行逆转录反应，从而得到含cDNA的逆转录产物；(d)对所述的逆转录产物进行PCR扩增，从而获得扩增产物；(e)对所述的扩增产物进行纯化，从而获得经纯化的扩增产物；和(f)对所述经纯化的扩增产物进行建库和测序，从而获得单细胞转录组测序数据；其中，在步骤(b)、(c)和(d)各步骤以及其间均不包括核酸纯化操作；并且，在步骤(b)、(c)和(d)均在同一反应容器中进行。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的单细胞是新鲜的单细胞或固定后的单细胞。3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(b)中，所述蛋白酶K的用量为0.2
‑
1.5mg/ml(μg/μl),即(0.4
‑
4.5μg)蛋白酶K/(2
‑
3μl)裂解反应体积。4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(c)中所述的逆转录反应的反应体系中含有大分子聚乙二醇，所述大分子聚乙二醇选自下组：PEG6000、PEG7000、PEG8000、PEG9000或其组合，优选地为PEG8000。5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述PEG8000在反应体系中的终浓度为6
‑
10％(v/v)，优选地为7.5％。6.一种用于单细胞转录组测序的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒...

【专利技术属性】
技术研发人员：何杰，金梦梦，汤霞，刘志勇，
申请(专利权)人：中国科学院脑科学与智能技术卓越创新中心，
类型：发明
国别省市：