一种提取口腔黏膜核酸进行全基因组高通量测序的方法技术

本发明专利技术公开了一种提取口腔黏膜核酸进行全基因组高通量测序的方法。本发明专利技术的方法包括：在采集的口腔黏膜样本中加入GT Buffer和蛋白酶K依次进行提取、裂解、离心后，采用仪器自动抽提口腔黏膜样本gDNA；将样本gDNA进行PCR片段化、末端修复加A，获得加A后的gDNA；将加A后的gDNA与接头连接，获得连接产物；将上述连接产物进行纯化后，上机测序。本发明专利技术还提供了一种提取口腔黏膜核酸进行全基因组高通量测序的试剂盒。本发明专利技术通过对口腔黏膜样本核酸抽提后进行全基因组高通量测序，具有采集方便、可以实现全自动化抽提核酸的优点，且无需抽取血液，属于无创检测，为临床病理研究提供了新的高效测序方法。了新的高效测序方法。了新的高效测序方法。

【技术实现步骤摘要】
一种提取口腔黏膜核酸进行全基因组高通量测序的方法


[0001]本专利技术涉及一种提取口腔黏膜核酸进行全基因组高通量测序的方法，属于生物检测


技术介绍

[0002]全基因组测序(Whole Genome Sequencing，WGS)是利用高通量测序平台对人类不同个体或群体进行全基因组测序，并在个体或群体水平上进行生物信息学分析。可全面挖掘DNA水平的遗传变异，为筛选疾病的致病及易感基因和研究发病及遗传机制提供重要信息。相较于全外显子组测序来说，全基因组测序由于结果包含完整丰富的信息，可以得到外显子测序或靶向测序不能得到的更多信息，具有其独特的优势。且随着近年来测序技术的不断进步、测序成本的不断降低，使得全基因组测序变得触手可及。而且全基因组测序在鉴定单核苷酸变异(SNP)、插入和缺失突变(Indel)时更有优势，所以全基因组测序逐渐成为了临床和基础研究的另一种选择。
[0003]然而现有技术是采用血液作为样本进行核酸抽提后进行全基因组高通量测序检测，需要对检测者进行抽血后检测，属于微创检测。

技术实现思路

[0004]本专利技术旨在提供一种自动提取口腔黏膜核酸进行全基因组高通量测序的方法，提供一种自动化程度高的无创检测方法。
[0005]为了实现上述目的，本专利技术提供了一种提取口腔黏膜核酸进行全基因组高通量测序的方法，包括如下步骤：
[0006]步骤1：在采集的口腔黏膜样本中加入GT Buffer和蛋白酶K依次进行提取、裂解、离心后，采用全自动核酸纯化仪进行抽提纯化，获得样本gDNA；
[0007]步骤2：将样本gDNA进行PCR片段化、末端修复加A，获得加A后的gDNA；
[0008]步骤3：将加A后的gDNA与接头连接，获得连接产物；
[0009]步骤4：将上述连接产物进行纯化后，采用高通量测序仪上机测序。
[0010]优选地，所述步骤1中裂解的温度为65℃，时间为≥30min。
[0011]优选地，所述步骤2中样本gDNA进行PCR片段化的反应体系包括：35μlDNA 、5μl 10
×
KAPA Frag Buffer和10μl KAPA Frag Enzyme；其中，35μl的DNA包括样本gDNA50
‑
200ng和余量的PCR级水。
[0012]优选地，所述步骤2中末端修复加A的反应体系包括：50μl的PCR片段化产物、7μl KAPA End Repair&A
‑
Tailing Buffer和3μl KAPA HyperPlus End Repair&A
‑
Tailing Enzyme Mix。
[0013]优选地，所述步骤3中采用的接头为KAPA Unique Dual
‑
Indexed Adapter，所述接头连接的反应体系包括：加A后的gDNA 60μl、KAPA Unique Dual
‑
Indexed Adapter 5μl、PCR
‑
grade water 5μl、Ligation Buffer 30μl和DNA Ligase 10μl。
[0014]优选地，所述步骤4中采用磁珠法对连接产物进行纯化。
[0015]本专利技术还提供了一种提取口腔黏膜核酸进行全基因组高通量测序的试剂盒，包括以下组分：
[0016]提取试剂：用于提取口腔黏膜样本中的核酸所用到的试剂；
[0017]片段化试剂和末端修复加A试剂：将基因组DNA进行PCR片段化和末端修复加A所用到的试剂；
[0018]连接试剂：用于接头连接所需的连接酶、连接缓冲液和接头；
[0019]以及纯化试剂：用于纯化连接产物所用到的试剂。
[0020]优选地，所述提取试剂包括GT Buffer和蛋白酶K；所述片段化试剂包括10
×
KAPA Frag Buffer和KAPA Frag Enzyme；所述末端修复加A试剂包括KAPA End Repair&A
‑
Tailing Buffer和KAPA HyperPlus End Repair&A
‑
Tailing Enzyme Mix；所述连接试剂包括KAPA Unique Dual
‑
Indexed Adapter、Ligation Buffer和DNA Ligase；所述纯化试剂包括AMPure XP核酸纯化试剂盒。
[0021]与现有技术相比，本专利技术的有益效果在于：
[0022](1)本专利技术通过对口腔黏膜样本核酸抽提后进行全基因组高通量测序，具有采集方便、可以实现全自动化抽提核酸的优点，可以减少人为操作给样本造成的污染及提供效率，且无需抽取血液，属于无创检测；
[0023](2)本专利技术的测序方法中，各步骤所采用的条件均是通过大量实验所得的优化条件，在此优化条件下，可以实现简便且高效地对口腔黏膜样本进行全基因组高通量测序，为临床病理研究提供了新的高效测序方法。
附图说明
[0024]图1为自动化抽提口腔拭子核酸上机操作示意图。
具体实施方式
[0025]为使本专利技术更明显易懂，兹以优选实施例，并配合附图作详细说明如下。
[0026]实施例1
[0027]本实施例提供了一种提取口腔黏膜核酸进行全基因组高通量测序的方法，具体步骤如下：
[0028]1、干燥的口腔拭子的自动化抽提：
[0029](1)取拭子棉头至1.5ml EP管中；
[0030](2)EP管中加入500μl GT Buffer和20μl PK(10mg/ml)；
[0031](3)将EP管放置恒温金属浴65℃30min以上(1h以上效果最佳)；
[0032](4)将裂解好的样本取出，使用离心机13000g离心5min；
[0033](5)取上清液400μl转移至螺口样品管中，准备上机；
[0034](6)上机操作：在全自动核酸纯化仪HF48上进行抽提纯化，螺口样本管放置W1孔位，枪头放置W3孔位，收集管放置W4孔位，选用C1003试剂条。如图1所示；选择程序C1003
‑
400
‑
tris
‑
60/100
‑
start，从而抽提得到口腔黏膜gDNA。
[0035]2、全基因组测序：
[0036](1)DNA片段化：
[0037]样本准备：
[0038]KAPA Frag Buffer(10
×
)和KAPA Frag Enzyme置于冰盒上解冻。
[0039]取50
‑
200ng gDNA，用PCR级水补足体积至35μl。
[0040]按照下表在热循环仪设置程序“Frag gDNA”(热本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种提取口腔黏膜核酸进行全基因组高通量测序的方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤1：在采集的口腔黏膜样本中加入GT Buffer和蛋白酶K依次进行提取、裂解、离心后，采用全自动核酸纯化仪进行抽提纯化，获得样本gDNA；步骤2：将样本gDNA进行PCR片段化、末端修复加A，获得加A后的gDNA；步骤3：将加A后的gDNA与接头连接，获得连接产物；步骤4：将上述连接产物进行纯化后，采用高通量测序仪上机测序。2.如权利要求1所述的提取口腔黏膜核酸进行全基因组高通量测序的方法，其特征在于，所述步骤1中裂解的温度为65℃，时间为≥30min。3.如权利要求1所述的提取口腔黏膜核酸进行全基因组高通量测序的方法，其特征在于，所述步骤2中样本gDNA进行PCR片段化的反应体系包括：35μl DNA、5μl 10
×
KAPA Frag Buffer和10μl KAPA Frag Enzyme；其中，35μl的DNA包括样本gDNA50
‑
200ng和余量的PCR级水。4.如权利要求1所述的提取口腔黏膜核酸进行全基因组高通量测序的方法，其特征在于，所述步骤2中末端修复加A的反应体系包括：50μl的PCR片段化产物、7μl KAPA End Repair&A
‑
Tailing Buffer和3μl KAPA HyperPlus End Repair&A
‑
Tailing Enzyme Mix。5.如权利要求1所述的提取口腔黏膜核酸进行全基因组高通量测序的方法，其特征在于，所述步骤3中采用的接头为KAPA Unique Dual
‑
Indexe...

【专利技术属性】
技术研发人员：江峥增，纪元，岳蕾，张苗苗，郝洁，韩晶，鲁姗姗，章琼燕，彭睿，蔡儒婧，张小垒，李思彤，
申请(专利权)人：复旦大学附属中山医院，
类型：发明
国别省市：