四氢嘧啶生物合成基因簇、突变体及制备四氢嘧啶的方法技术

本发明专利技术提供了一种四氢嘧啶的生物合成基因簇，通过重组表达发酵生产复筛，获得能利用天冬氨酸稳定高产四氢嘧啶的重组大肠杆菌。突变之前的基因簇同等发酵条件产量高了近30%，经过突变，效率进一步得到提升约20%。效率进一步得到提升约20%。效率进一步得到提升约20%。

【技术实现步骤摘要】
四氢嘧啶生物合成基因簇、突变体及制备四氢嘧啶的方法


[0001]本专利技术涉及合成生物
，具体涉及一种四氢嘧啶生物合成基因簇及制备四氢嘧啶的方法。

技术介绍

[0002]嗜盐菌属于一种极端微生物，根据其对NaCl的耐受程度可以分为轻度嗜盐菌（最适 NaCl 浓度为10
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30 g/L）、中度嗜盐菌（最适 NaCl 浓度为50
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100 g/L）和极端嗜盐菌（最适NaCl 浓度为130
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150 g/L）。为了维持细胞内外的渗透压平衡，在嗜盐菌细胞中会积累一些物质以抵抗外界的高渗环境，这类物质主要包括氨基酸及其衍生物、多元醇、糖类以及四氢嘧啶(Ectoine,1,4,5,6
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tetrahydro
‑2‑
methyl
‑4‑
pyrimidinecarboxylic acid)类，其中四氢嘧啶具有重要的应用价值。
[0003]1985年，Galinski等首次在极端嗜盐的Halorhodospira halochlors中发现四氢嘧啶，并鉴定其结构，Ectoine 分子量为142.16，极具亲水性，属于两性离子特征的有机小分子，结构式如下所示。
[0004]四氢嘧啶在胞内大量积聚，可抵抗高渗透压的冲击，同时可以稳定蛋白的水化层结构（尤其在冷冻、干燥与高温条件下）。近年来的研究表明四氢嘧啶对体内和体外的酶、DNA和膜等大分子具有稳定作用；能够防止皮肤失水和干燥同时降低紫外线对皮肤的损伤度，另外四氢嘧啶可以抑制类淀粉蛋白的形成，能够降低类淀粉蛋白形成的起始和伸长阶段，因而具有潜在的预防老年痴呆症的功能。
[0005]由于四氢嘧啶分子中具有一个手性碳原子，因此很难用化学方法合成，现有的生产方法主要为微生物发酵法。目前，广泛应用于 Ectoine工业规模生产的模式菌株主要集中在γ
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变形菌纲盐单胞菌科（Halomonadaceae），尤以盐单胞菌属（Halomonas）居多。经过几十年的研究，四氢嘧啶的合成途径已在基因水平、酶水平和调控水平上有了较为深入的发展。Halomonas作为四氢嘧啶合成研究的模式种群，报道了H.elongate DSM 2581、H.elongate DSM 3043、H. elongate ATCC33174中Ectoine的合成代谢途径。在上述四氢嘧啶的合成代谢途径中，以L
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lysine 生物合成途径中的天冬氨酸半醛(L
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aspartate
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B
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semialdehyde)为前体，依赖于进化高度保守的连锁ectABC基因簇操纵子(ect
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operon)。结构基因ectB、ectA和 ectC分别编码L
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二氨基丁酸转氨酶（ectB）、L
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二氨基丁酸乙酰转移酶（ectA）和四氢密啶合酶（ectC）经3步催化合成四氢嘧啶。
[0006]采用现有的代谢途径合成四氢嘧啶存在产量低的缺陷，从而限制了四氢嘧啶的大规模产业化应用，如何提高天冬氨酸高产四氢嘧啶的方法成为行业研究的重点。
[0007]专利技术人利用在进行盐湖淤泥采样后进行宏基因组测序分析，并通过序列比对筛选获得若干全新序列的ectABC基因簇，经基于NCBI数据库的BLAST比对搜索，ectABC核苷酸序列与其他盐单胞菌有明显差异，通过重组表达发酵生产复筛，获得能利用天冬氨酸稳定高产四氢嘧啶的重组大肠杆菌，随后对ectABC基因簇进行突变设计，增强了活性，进一步提高了四氢嘧啶的转化效率。

技术实现思路

[0008]本专利技术所要解决的技术问题是提供一种用于合成四氢嘧啶的基因簇ectABC，其能够用于高效合成四氢嘧啶，大幅提高其产量。
[0009]基于此，本专利技术提供一种四氢嘧啶的生物合成基因簇，至少包括3个基因，分别为：ectA基因，核酸序列如SEQ ID NO.1所示；ectB基因，核酸序列如SEQ ID NO.2所示；ectC基因，核酸序列如SEQ ID NO.3所示。
[0010]所述基因簇来源于盐单胞菌株Halomonas sp. YL01，其保藏于广东省微生物菌种保藏中心 （GDMCC），地址：广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，邮编：510070， 保藏日期为2022年4月24日，保藏编号为GDMCC No: 62420。
[0011]本专利技术还提供一种四氢嘧啶的生物合成基因簇的获取方法，第一步，菌株筛分，对盐湖淤泥所含有的菌株筛分；第二步，PCR扩增验证；第三步，基因组测序，获得基因簇。
[0012]本专利技术还提供一种四氢嘧啶的生物合成基因簇突变体，其ectA基因，核酸序列如SEQ ID NO.1所示原始序列的基础上具有如下突变：核酸序列对应的多肽氨基酸序列在第39位氨基酸由N替换成S，且第132位氨基酸由A替换成T，其突变后的多肽氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。
[0013]其ectB基因，核酸序列如SEQ ID NO.2所示原始序列的基础上具有如下突变：核酸序列对应的多肽氨基酸序列在第59位氨基酸由I替换成L，第71位氨基酸由N替换成G，第179位氨基酸由A替换成T，且第381位氨基酸由V替换成I，其突变后的多肽氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示。
[0014]其ectC基因，核酸序列如SEQ ID NO.3所示原始序列的基础上具有如下突变：核酸序列对应的多肽氨基酸序列在第62位氨基酸由F替换成Y，其突变后的多肽氨基酸序列如SEQ ID NO.10所示。
[0015]上述合成基因簇突变体的构建方法，包括：第一步，底盘菌基因簇提取；第二步，表达载体骨架及上述提取的基因簇PCR扩增；第三步，重组表达质粒构建；第四步，突变体构建。
[0016]含上述合成基因簇或基因簇突变体的表达载体或重组微生物工程菌。
[0017]上述基因簇、基因簇突变体、表达载体、重组微生物工程菌在合成四氢嘧啶过程中的应用。
[0018]本专利技术还提供采用上述重组微生物工程菌生产四氢嘧啶的方法，通过全细胞转化葡萄糖生成四氢嘧啶。
[0019]所述方法进一步包括：第一步，种子液制备；第二步，四氢嘧啶发酵；第三步，四氢嘧啶的制备。
[0020]本专利技术具有以下有益技术效果：本专利技术提供一种用于合成四氢嘧啶的基因簇ectABC及其突变体，其能够用于高效合成四氢嘧啶，经研究发现，基因簇ectABC编码的酶催化效率更好，同等发酵条件产量高了近30%，同时在这个基因簇上做了突变，效率进一步得到提升约20%。
附图说明
[0021]图1为重组大肠杆菌产四氢嘧啶的液相质谱分析；图2 为本专利技术中ectA基因与Halomonas aestuarii Hb3、Halomonas sp. THAF5a、Halomonas sp. JS92
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SW72、Halomonas sp. 本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种四氢嘧啶的生物合成基因簇，其特征在于：至少包括3个基因，分别为：ectA基因，核酸序列如SEQ ID NO.1所示；ectB基因，核酸序列如SEQ ID NO.2所示；ectC基因，核酸序列如SEQ ID NO.3所示。2.如权利要求1所述的四氢嘧啶的生物合成基因簇，其特征在于：所述基因簇来源于盐单胞菌株Halomonas sp. YL01，其保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏日期为2022年4月24日，保藏编号为GDMCC No: 62420。3.如权利要求1或2所述的四氢嘧啶的生物合成基因簇的获取方法，其特征在于，包括：第一步，菌株筛分，对盐湖淤泥所含有的菌株筛分；第二步，PCR扩增验证；第三步，基因组测序，获得基因簇。4.权利要求1或2所述的四氢嘧啶的生物合成基因簇形成的突变体，其特征在于，包括：在核酸序列如SEQ ID NO.1所示的ectA基因原始序列的基础上具有如下突变：核酸序列对应的多肽氨基酸序列在第39位氨基酸由N替换成S，且第132位氨基酸由A替换成T，其突变后的多肽氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。5.权利要求1或2所述的四氢嘧啶的生物合成基因簇形成的突变体，其特征在于，包括：在核酸序列如SEQ ID NO.2所示的ectB基因原始序列的基础上具有如下突变：核酸序列对应...

【专利技术属性】
技术研发人员：叶健文，周明新，
申请(专利权)人：深圳中科翎碳生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：