通过精准编辑内源EPSPS基因获得抗草甘膦水稻的方法及其所用系统技术方案

本发明专利技术公开了通过精准编辑内源EPSPS基因获得抗草甘膦水稻的方法及其所用系统。本研究以OsEPSPS为靶标基因，通过自剪切多肽T2A将RAD52和引导编辑器融合表达，构建新型的引导编辑系统，利用RAD52可以促进基因组DNA与同源的ssRNA之间链交换的方法，来提高引导编辑系统的编辑效率，为农作物精准设计分子育种提供了新技术和新方法。另外，草甘膦是世界上应用最多的除草剂，对人畜与环境危害极小。本研究获得的高抗草甘膦除草剂的水稻编辑植株为培育新型高抗草甘膦除草剂的水稻新种质提供了新材料，有望大大提高水稻生产的经济性，也为获得其它新型高抗草甘膦除草剂的作物新种质提供了参考。提供了参考。

【技术实现步骤摘要】
et al.,2002)。
[0005]研究表明，重要农作物的部分优良农艺性状都与碱基突变密切相关，其中大部分变异来自于单核苷酸差异，另外也有相当一部分变异来源于小片段的插入和缺失。目前，基于同源重组修复途径介导的基因任意替换在植物细胞内效率仍然偏低，仅在少数实验室可行(Li and Xia,2019)。另外，单碱基编辑系统只能实现碱基间的转换，而对碱基巅换和小片段的精准插入与删除尚无高效的方法可以实现。近年来兴起的引导编辑系统不需要借助DNA双链断裂缺口和外源供体修复模板的帮助，即可在基因组DNA上实现精准的单碱基替换(包括转换和巅换)以及小片段的插入与删除，在基因组精准修饰方面具有巨大的应用前景，然而目前该系统在植物细胞中的效率偏低。
[0006]因此，如何构建高效的引导编辑体系，是农作物精准改良的热点问题。

技术实现思路

[0007]本专利技术要解决的技术问题是如何精确、快速的制备抗草甘膦水稻。
[0008]为解决上述技术问题，第一个方面，本专利技术提供产生抗草甘膦水稻的方法，所述方法包括将靶向水稻基因组中5
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烯醇丙酮莽本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.产生抗草甘膦水稻的方法，其特征在于：所述方法包括将靶向水稻基因组中5
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烯醇丙酮莽草酸
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磷酸合成酶基因的引导编辑系统表达载体导入待编辑水稻，得到抗草甘膦水稻；引导编辑系统表达载体包括融合蛋白的编码基因、pegRNA的编码基因和介导非靶向DNA单链切刻(nick)的sgRNA的编码基因，所述融合蛋白是由核定位信号1
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N、nCas9(H840A)、M
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MLV
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RT、核定位信号1
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C、自剪切多肽、核定位信号2
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N、RAD52和核定位信号2
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C连接而成的蛋白质；所述pegRNA包括介导靶向DNA单链切刻(nick)的sgRNA、引物结合位点和储存有靶向位点编辑信息的反转录模板，所述靶向位点为所述水稻基因组中EPSPS基因。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述RAD52为如下B1)
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B3)中任一种蛋白质：B1)、由编码链的编码序列是序列表中序列1第19733
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21007位核苷酸编码的蛋白质；B2)、将B1)所示的蛋白质经过一个以上氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与B1)所示的氨基酸序列具有80％以上同一性，且具有相同生物学功能的蛋白质；B3)、在B1)或B2)所示的蛋白质的羧基端或/和氨基端融合蛋白标签得到的融合蛋白；所述nCas9(H840A)为如下B11)
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B13)中任一种蛋白质：B11)、由编码链的编码序列是序列表中序列1第13313
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17413位核苷酸编码的蛋白质；B12)、将B11)所示的蛋白质经过一个以上氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与B1)所示的氨基酸序列具有80％以上同一性，且具有相同生物学功能的蛋白质；B13)、在B11)或B12)所示的蛋白质的羧基端或/和氨基端融合蛋白标签得到的融合蛋白；所述M
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MLV
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RT为如下B21)
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B23)中任一种蛋白质：B21)、由编码链的编码序列是序列表中序列1第17414
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19585位核苷酸编码的蛋白质；B22)、将B21)所示的蛋白质经过一个以上氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与B1)所示的氨基酸序列具有80％以上同一性，且具有相同生物学功能的蛋白质；B23)、在B21)或B22)所示的蛋白质的羧基端或/和氨基端融合蛋白标签得到的融合蛋白。3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述融合蛋白包括如下任一种蛋白质：R1)、由编码链的编码序列是序列表中序列1第13313
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21055位核苷酸编码的蛋白质；R2)、将R1)所示的蛋白质经过一个以上氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与R1)所示的氨基酸序列具有80％以上同一性，且具有相同生物学功能的蛋白质；R3)、在R1)或R2)所示的蛋白质的羧基端或/和氨基端融合蛋白标签得到的融合蛋白。4.如权利要求1
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3中任一所述的方法，其特征在于：所述融合蛋白的编码基因是序列表中序列1第13313
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21055位核苷酸所示的DNA分子。5.如权利要求1
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4中任一所述的方法，其特征在于：所述介导靶向DNA单链切刻(nick)的sgRNA的靶标序列为SEQ ID No.2第453
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472所示核苷酸序列，所述反转录模板的编码序列如序列表中序列1第23501
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23559位核苷酸所示的DNA分子。6.如权利要求1
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5中任一所述的方法，其特征在于：所述引导编辑系统表达载体包括WUS表达盒，所述WUS表达盒如序列表中序列1第8900
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11168位核苷酸所示，其中第8900
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9954位为PLTP启动子序列，第9955
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10915为WUS编码序列，第10916
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11168为Nos终止子序列。
7.权利...

【专利技术属性】
技术研发人员：夏兰琴，李晶莹，
申请(专利权)人：中国农业科学院作物科学研究所，
类型：发明
国别省市：