gat3基因及其突变体在培育抗草甘膦作物中的应用制造技术

本发明专利技术公开了gat3基因及其突变体在培育抗草甘膦作物中的应用。所述gat3基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID No：1所示；突变体包括gat3

【技术实现步骤摘要】
gat3基因及其突变体在培育抗草甘膦作物中的应用


[0001]本专利技术属于植物生物
，具体涉及gat3基因及其突变体在培育抗草甘膦作物中的应用。

技术介绍

[0002]草甘膦是唯一能够有效抑制植物莽草酸代谢途径中磷酸烯醇式丙酮酸莽草酸
‑3‑
磷酸合酶（5
‑
enolpyruvylshikimate
‑3‑
phosphate synthase，EPSPS）的活性，从而阻断芳香族氨基酸的生物合成，最终导致植物发生死亡。在自然界中存在着对草甘膦具有天然抗性的植物，科研者从中发现了不同的抗性机制，并利用这些抗性基因获得草甘膦高耐受性的转基因作物。在现有的抗草甘膦策略中，可大致分为两大类机制：靶点抗性和非靶点抗性。靶点抗性主要就是针对EPSPS的相关机制，如过表达或突变。非靶点抗性可分为化学修饰、氧化降解、转运等相关机制。
[0003]2004年，Castle等首次发表了关于草甘膦N
‑
乙酰化修饰的研究成果，其团队从土壤微生物地衣芽孢杆菌Bacillus licheniformis中分离到一种草甘膦N
‑
乙酰基转移酶（Glyphosate N
‑
acetyltransferase, GAT），并通过11轮DNA shuffling获得高催化效率的GAT酶。该酶属于GNAT超家族，可将乙酰基转移到草甘膦的仲胺上，对EPSP合成酶就不再具有抑制作用，从而失去了除草剂活性。本专利技术希望能够找到天然活性高的GAT酶，并置换更佳的氨基酸残基来改变GAT酶的活性，同时，实验中将以Castle团队中第11轮的GAT酶作为阳性对照，并暂名为GAT
C11
。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的在于提供gat3基因及其突变体在培育抗草甘膦作物中的应用。
[0005]一种gat3基因，所述gat基因的多核苷酸为 （a）、（b）、（c）或（d）所示：（a）如序列表SEQ ID No：1 所示的多核苷酸；或（b）与SEQ ID No：1的互补序列在严谨杂交条件能够进行杂交的多核苷酸，该多核苷酸所编码蛋白质仍具有抗草甘膦活性；（c）与SEQ ID No：1所示的多核苷酸至少有90%或以上同源性的多核苷酸；或（d）在SEQ ID No：1所示的多核苷酸的基础上进行一个或多个碱基的缺失、取代或插入得到的多核苷酸突变体，且该多核苷酸突变体所编码的蛋白仍具有抗草甘膦活性。
[0006]一种gat3蛋白，所述gat3蛋白的氨基酸序列为 （a）、（b）或（c）所示：（a）如序列表SEQ ID No：2 所示的氨基酸序列；或（b）与SEQ ID No：2所示的氨基酸至少有90%或以上同源性的氨基酸；或（c）在SEQ ID No：2所示的蛋白基础上进行一个或多个氨基酸的缺失、取代或插入得到的蛋白突变体，且该蛋白仍具有抗草甘膦活性。
[0007]一种gat3蛋白突变体，所述突变体包括gat3
‑
17、gat3
‑
35、gat3
‑
38、gat3
‑
53、gat3
‑
77、gat3
‑
93；所述突变体gat3
‑
17为gat3蛋白的氨基酸序列第17位氨基酸残基由L突
变为I；所述突变体gat3
‑
35为gat3蛋白的氨基酸序列第35位氨基酸残基由S突变为G；所述突变体gat3
‑
38为gat3蛋白的氨基酸序列第38位氨基酸残基由M突变为D；所述突变体gat3
‑
53为gat3蛋白的氨基酸序列第53位氨基酸残基由I突变为V；所述突变体gat3
‑
77为gat3蛋白的氨基酸序列第77位氨基酸残基由V突变为M；所述突变体gat3
‑
93为gat3蛋白的氨基酸序列第93位氨基酸残基由V突变为I。
[0008]包含所述gat3基因的载体。
[0009]包含所述gat3基因载体的工程菌。
[0010]检测所述gat3基因任一片段的引物。
[0011]所述gat3蛋白或所述gat3蛋白的突变体在培育抗草甘膦作物中的应用。
[0012]本专利技术的有益效果：本专利技术从Pfam数据库筛选到一个高抗草甘膦的gat3基因，并且对gat3蛋白进行点突变，进一步获得更高抗草甘膦的gat3蛋白突变体，为培育高抗草甘膦的农作物打下基础。
附图说明
[0013]图1 为pET28a
‑
gat1载体图谱。
[0014]图2 为含100 mM草甘膦LK平板定性筛选抗性菌株。
[0015]图3 为pET28a
‑
gat N转化菌株的MIC值。
[0016]图4 为pET28a
‑
gat N转化菌株的生长曲线。
[0017]图5 为含100 mM草甘膦LK平板定性筛选抗性菌株。
[0018]图6 为pET28a
‑
mgat3
‑
N转化菌株的MIC值。
具体实施方式
[0019]为了便于理解本专利技术，下面将对本专利技术进行更全面的描述。但是，本专利技术可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本专利技术的公开内容的理解更加透彻全面。
[0020]实施例1 载体构建gat抗性基因的选择：在Pfam数据库（http://pfam.xfam.org/）中下载PF00583（Pfam: Family: Acetyltransf_1 (PF00583) (xfam.org) ）蛋白家族的信息，并利用hmmsearch在Uniparc database搜索到3043条序列。将上述序列按照90%相似性进行聚类分析，可分为1196类，以类中心序列数值从大至小进行排序，并从中选出18条序列（cluster number > 20），依次命名为gat 1
ꢀ‑ꢀ
gat 18。
[0021]18条序列及gat
c11
（第11轮筛选结果）由常州基宇公司按照大肠杆菌密码子优化并合成各序列片段。以BamHⅠ/SacⅠ双酶切合成载体及pET28a+（R）载体，前者用于回收合成片段，后者用于提供载体骨架，各合成片段分别与载体骨架连接形成如图1所示的pET28a
‑
gat1筛选载体。
[0022]将构建的18个筛选载体转化至Trans1
‑
T1菌株中保存，同时，转化至BL21（DE3）菌株中进行后续筛选实验。所有菌株均在
‑
20℃冰箱及
‑
80℃冰箱各留存一份。载体骨架和基因片段是通过酶切线性化后用T
4 DNA酶连接而成，因此需以酶切的方法对构建的载体进行再次鉴定。挑取转化涂板后培养出的单克隆于5 mL 本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种gat3基因，其特征在于，所述gat3基因的多核苷酸为 （a）、（b）、（c）或（d）所示：（a）如序列表SEQ ID No：1 所示的多核苷酸；或（b）与SEQ ID No：1的互补序列在严谨杂交条件能够进行杂交的多核苷酸，该多核苷酸所编码蛋白质仍具有抗草甘膦活性；（c）与SEQ ID No：1所示的多核苷酸至少有90%或以上同源性的多核苷酸；或（d）在SEQ ID No：1所示的多核苷酸的基础上进行一个或多个碱基的缺失、取代或插入得到的多核苷酸突变体，且该多核苷酸突变体所编码的蛋白仍具有抗草甘膦活性。2.一种gat3蛋白，其特征在于，所述gat3蛋白的氨基酸序列为 （a）、（b）或（c）所示：（a）如序列表SEQ ID No：2 所示的氨基酸序列；或（b）与SEQ ID No：2所示的氨基酸至少有90%或以上同源性的氨基酸；或（c）在SEQ ID No：2所示的蛋白基础上进行一个或多个氨基酸的缺失、取代或插入得到的蛋白突变体，且该蛋白仍具有抗草甘膦活性。3.权利要求2所述gat3蛋白的突变体，其特征在于，所述突变体包括gat3
‑
17、gat3
‑
35、gat3
‑<...

【专利技术属性】
技术研发人员：柳小庆，苗丽青，田健，陈茹梅，李素贞，周晓今，杨文竹，
申请(专利权)人：中国农业科学院生物技术研究所，
类型：发明
国别省市：