一种视网膜色素变性疾病模型的构建方法及其应用技术

本发明专利技术公开了一种视网膜色素变性疾病模型的构建方法及其应用，涉及医学工程技术领域。其包括：敲除非人目标哺乳动物视网膜视杆细胞基因组中的Wtap基因序列。通过敲除非人目标哺乳动物视网膜视杆细胞基因组中的Wtap基因序列可以使得敲除Wtap基因的目标动物表现出视网膜色素变性疾病相关的特征。例如视杆细胞死亡，主要表现为光感受器受损、变性，视网膜外核层逐渐变薄直至消失，视网膜外网层及其他相关细胞层出现相应病理改变。因此，视网膜视杆细胞中的Wtap基因被敲除的非人目标哺乳动物可以作为视网膜色素变性疾病模型。物可以作为视网膜色素变性疾病模型。物可以作为视网膜色素变性疾病模型。

【技术实现步骤摘要】
一种视网膜色素变性疾病模型的构建方法及其应用


[0001]本专利技术涉及医学工程
，具体而言，涉及一种视网膜色素变性疾病模型的构建方法及其应用。

技术介绍

[0002]视网膜色素变性(Retinitis pigmentosa,RP)是感光细胞和色素上皮共同发生退行性病变的遗传性致盲眼底病，其特征为视杆细胞出现变性，进而视锥细胞受累，最终所有感光细胞变性。其中典型RP患者表现为视杆细胞普遍受损；非典型RP患者则以视锥细胞受损为主。典型的RP患者最初由于视杆细胞受损而出现夜盲，视野逐渐缩小，视力逐渐减退，最终失明。
[0003]而目前对于RP的诊断和治疗依然面临许多困难，这主要归因于其在临床表型和遗传上的高度异质性，并且其致病机制研究不足，导致RP的具体分子机制尚不清楚，这为RP的诊断和治疗带来了极大阻碍，有必要对RP的详细致病机制进行深入研究，因此构建相应的RP疾病模型变得尤为重要。
[0004]鉴于此，特提出本专利技术。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的在于提供一种视网膜色素变性疾病模型的构建方法及其应用以解决上述技术问题。
[0006]Wtap(Wilms tumour 1
‑
associating protein，MGI:1926395)，该基因位于小鼠17号染色体12966799
‑
12992543bp，全长25.7kb，其cDNA全长4967bp，包含8个外显子。已有的研究表明Wtap作为甲基转移酶复合体的一部分参与RNA的m6A甲基化修饰过程，其广泛分布于各种类型的组织细胞中。m6A甲基化的形成过程主要是由甲基转移酶复合体(METTL3,METT14和WTAP等组成)、去甲基酶(FTO和ALKBH5)以及阅读蛋白(YTHDF1/2/3,YTHDC1/2)来进行动态调控，与基因表达调控密切相关。其次，m6A可能参与了mRNA转录、选择性剪切、出核转运、翻译以及降解等生物学过程，从而导致RNA功能紊乱，进而影响一系列的动物生命活动。目前针对WTAP蛋白功能的研究逐渐增多，主要包括在肿瘤发生、机体发育等方面的影响，但其详细作用机制以及其在视网膜中的生物学功能还不甚明了，限制了其开发应用。因此，深入研究WTAP对视网膜色素变性疾病的治疗及病因探讨潜力巨大。
[0007]本专利技术是这样实现的：
[0008]本专利技术提供了一种视网膜色素变性疾病模型的构建方法，其包括：敲除非人目标哺乳动物视网膜视杆细胞基因组中的Wtap基因序列。
[0009]专利技术人发现，通过敲除非人目标哺乳动物视网膜视杆细胞基因组中的Wtap基因序列可以使得敲除Wtap基因的目标动物表现出视网膜色素变性疾病相关的特征。例如视杆细胞死亡，主要表现为光感受器受损、变性，视网膜外核层逐渐变薄直至消失，视网膜外网层及其他相关细胞层出现相应病理改变。因此，视网膜视杆细胞中的Wtap基因被敲除的动物
可以作为视网膜色素变性疾病模型。
[0010]本专利技术提供的视网膜色素变性疾病模型可以用于视网膜色素变性疾病研究等领域中，为该疾病的研究例如发病过程、机制以及相关药物的筛选提供了一种新的模型，为深入研究WTAP对视网膜色素变性疾病的治疗及病因探讨提供良好的模型基础。
[0011]在本专利技术应用较佳的实施方式中，上述敲除非人目标哺乳动物视网膜视杆细胞基因组中的Wtap基因序列是指：敲除Wtap基因的外显子序列。
[0012]上述敲除非人目标哺乳动物视网膜视杆细胞基因组中的Wtap基因序列，包括不限于敲除Wtap基因的全长序列、敲除Wtap基因的部分序列(例如部分外显子序列)。无论敲除哪一种种类型(部分或全长)的序列，只要是能够在视杆细胞中沉默Wtap基因的表达，使动物表现出视网膜色素变性性疾病相应特征即落入本专利技术的保护范围。
[0013]在本专利技术应用较佳的实施方式中，上述敲除非人目标哺乳动物视网膜视杆细胞基因组中的Wtap基因序列是指：敲除Wtap基因的第1外显子到第8外显子中的至少一个外显子的序列。
[0014]例如敲除第1外显子、第2外显子、第3外显子、第4外显子、第5外显子、第6外显子、第7外显子或第8外显子，例如同时敲除第1外显子、第2外显子和第3外显子。
[0015]在本专利技术应用较佳的实施方式中，上述敲除非人目标哺乳动物视网膜视杆细胞基因组中的Wtap基因序列是指：敲除Wtap基因的第3外显子、或敲除由第3外显子及其他外显子组成的外显子组合中的序列。
[0016]其他外显子选自如下外显子中的至少一种：第1外显子、第2外显子、第4外显子、第5外显子、第6外显子、第7外显子和第8外显子。
[0017]在本专利技术应用较佳的实施方式中，上述敲除采用的基因编辑技术包括：CRISPR/Cas9技术、人工核酸酶介导的锌指核酸酶技术(zinc
‑
finger nucleases，ZFN)、转录激活因子样效应物核酸酶技术(transceription activator
‑
like effector nucleases,TALEN)和Cre
‑
loxp基因敲除技术中的至少一种。
[0018]在本专利技术应用较佳的实施方式中，上述敲除采用的基因编辑技术包括：CRISPR/Cas9技术和Cre
‑
loxp基因敲除技术。
[0019]在本专利技术应用较佳的实施方式中，上述构建方法包括：将含非人目标哺乳动物Wtap基因的gRNA的供体载体和Cas9 mRNA转化至非人目标哺乳动物的受精卵中，取胚胎细胞移植到假孕非人目标哺乳动物的子宫中，获得Wtap基因条件性敲除的首建动物，将首建动物进行交配，获得视网膜视杆细胞Wtap条件性敲除动物；
[0020]gRNA具有loxP位点。
[0021]上述将首建动物进行交配，获得视网膜视杆细胞Wtap条件性敲除动物的过程包括：
[0022]将首建动物与目标野生型动物交配繁殖，获得杂合子Wtap基因条件性敲除动物；然后将得到的杂合子Wtap基因条件性敲除动物相互交配繁殖，得到Wtap基因条件性敲除纯合子动物。
[0023]将得到的Wtap基因条件性敲除纯合子动物与转Rod
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Cre基因动物交配，得到视网膜视杆细胞Wtap敲除基因动物，即可作为视网膜色素变性疾病模型。
[0024]转Rod
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Cre基因动物(小鼠)购买自杰克森实验室(Jackson Laboratory)的Rod
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Cre转基因小鼠(stock number:015850)。品系名全称：B6.Cg
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Pde6b+Tg(Rho
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icre)1Ck/Boc。
[0025]在本专利技术应用较佳的实施方式中，上述非人目标哺乳动物选自小鼠、大鼠、狗、猪、猴以及猿中的任意一种。无论选用何种动物，只要是具有Wtap基因的动物，均可作为本专利技术上述构建方法中的目标本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种视网膜色素变性疾病模型的构建方法，其特征在于，其包括：敲除非人目标哺乳动物视网膜视杆细胞基因组中的Wtap基因序列。2.根据权利要求1所述的视网膜色素变性疾病模型的构建方法，其特征在于，敲除非人目标哺乳动物视网膜视杆细胞基因组中的Wtap基因序列是指：敲除Wtap基因的外显子序列。3.根据权利要求2所述的视网膜色素变性疾病模型的构建方法，其特征在于，敲除非人目标哺乳动物视网膜视杆细胞基因组中的Wtap基因序列是指：敲除Wtap基因的第1外显子到第8外显子中的至少一个外显子的序列。4.根据权利要求3所述的视网膜色素变性疾病模型的构建方法，其特征在于，敲除非人目标哺乳动物视网膜视杆细胞基因组中的Wtap基因序列是指：敲除Wtap基因的第3外显子、或敲除由第3外显子及其他外显子组成的外显子组合中的序列；所述其他外显子选自如下外显子中的至少一种：第1外显子、第2外显子、第4外显子、第5外显子、第6外显子、第7外显子和第8外显子。5.根据权利要求4所述的视网膜色素变性疾病模型的构建方法，其特征在于，所述敲除采用的基因编辑技术包括：CRISPR/Cas9技术、ZFN技术、TALEN技术和Cre
‑
loxp基因敲除技术中的至少一种；所述敲除是敲除非人目标哺乳动...

【专利技术属性】
技术研发人员：朱献军，杨业明，孙宽祥，
申请(专利权)人：四川省医学科学院，
类型：发明
国别省市：