一种基因敲除载体及其构建方法与用途技术

本公开涉及生物技术领域，具体涉及一种基因敲除载体及其构建方法与用途。包括CRISPR/Cas9载体骨架与连接在所述载体骨架上的一段DNA片段，所述DNA片段能够特异性靶向编码斑马鱼PKR链接区的基因片段。该基因敲除载体能够精准敲除编码斑马鱼PKR链接区的基因片段，特别是能够精准敲除编码斑马鱼PKR链接区中包含碱性区在内的28个氨基酸的基因片段，使得斑马鱼体内能够表达有链接区碱性区缺失的PKR异构体，其单链RNA结合能力降低，特别是与5

【技术实现步骤摘要】
一种基因敲除载体及其构建方法与用途


[0001]本公开涉及生物
，具体涉及一种基因敲除载体及其构建方法与用途。

技术介绍

[0002]CRISPR/Cas9是基于II型CRISPR系统开发而来的，主要由RNA导向的Cas9核酸内切酶、一条导向RNA(sgRNA)和反式激活RNA(tracrRNA)组成。在这一系统中，crRNA(CRISPR
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derived RNA)通过碱基配对与tracrRNA结合形成双链RNA，引导Cas9蛋白至靶序列上，Cas9蛋白的两个功能域可以发挥内切酶的切割作用，即HNH和RuvC结构域，分别切割基因组上与crRNA的互补链和非互补链，造成DNA的双链断裂(doublestrandbreak,DSB)，从而启动细胞内的DNA损伤修复机制，导致修复后发生插入/缺失(indel)，达到移码突变的效果，最终实现基因敲除的目的，目前该技术已经成熟的运用于原核及真核生物的基因组编辑中。
[0003]非特异免疫是脊椎动物抵抗病毒侵入的第一道防线，干扰素系统则是机体非特异免疫抵抗感染和清除病毒的主要功能分子体系，而PKR(Double
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stranded RNA
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dependent protein kinase，PKR)是干扰素系统抗病毒作用的主要效应分子。PKR分子由N端的双链RNA结合结构域(Double
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stranded RNA binding domain,dsRBD)和C端的激酶结构域(Kinase domain,KD)串联而成，dsRBD和KD通过一个链接区(Linker)连接起来。PKR可识别和结合病毒的双链RNA，然后通过二聚化和自磷酸化激活其自身的蛋白激酶活性，活化的PKR能够磷酸化真核细胞翻译起始因子2α(eIF2α)，从而使其失去蛋白翻译起始活性，导致蛋白翻译起始的失败，引起蛋白翻译的抑制。因此，PKR一方面能抑制病毒RNA的复制，另一方面能抑制病毒和宿主细胞蛋白质的合成，最终导致病毒繁殖的抑制和感染病毒细胞的凋亡，并引起机体抗病毒免疫反应，限制病毒在体内的扩散。
[0004]本公开专利技术人发现，斑马鱼PKR在抑制病毒蛋白翻译的同时，也存在抑制斑马鱼抗病毒免疫相关细胞因子表达的现象，从而导致斑马鱼的抗病毒免疫功能受到限制。

技术实现思路

[0005]因此，本公开要解决的技术问题在于克服斑马鱼PKR因抑制斑马鱼抗病毒免疫相关细胞因子表达而导致斑马鱼的抗病毒免疫功能受到限制的缺陷，从而提供一种基因敲除载体及其构建方法与用途。
[0006]为此，本公开提供一种基因敲除载体，所述基因敲除载体包括CRISPR/Cas9载体骨架与连接在所述载体骨架上的一段DNA片段，所述DNA片段能够特异性靶向编码斑马鱼PKR链接区的基因片段。
[0007]可选的，所述DNA片段能够特异性靶向斑马鱼PKR基因中的第11位外显子。
[0008]可选的，所述DNA片段能够特异性靶向斑马鱼PKR基因中的第10位和第11位外显子。
[0009]可选的，所述DNA片段的序列如SEQ ID NO:3所示。
[0010]可选的，所述CRISPR/Cas9载体骨架为Cas9 mRNA体外转录载体Psp6
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2Snls
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spCas9和/或gRNA克隆与体外转录载体骨架p
‑
T7
‑
gRNA，优选为gRNA克隆与体外转录载体骨架p
‑
T7
‑
gRNA。
[0011]斑马鱼PKR基因(Genbank编号为NM_001114470.1)总共19个外显子，本公开的基因敲除载体能够剪切第10
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11外显子，形成斑马鱼PKR剪接异构体基因(Genbank编号为MH425504.1)，其中，第10外显子长度35nt，第11外显子长度49nt，被剪切总长度84nt，编码28个氨基酸残基，第10
‑
11外显子编码的氨基酸残基位于斑马鱼PKR蛋白结构的链接区，并且刚好位于链接区的碱性区。
[0012]本公开还提供上述任意一项所述基因敲除载体的构建方法，包括以下步骤：
[0013](1)基于斑马鱼PKR基因中的第10位和第11位外显子序列，设计打靶位点，所述10位外显子序列如SEQ ID NO:1所示，所述第11位外显子序列如SEQ ID NO:2所示，所述打靶位点的靶序列如SEQ ID NO:3所示；
[0014](2)根据SEQ ID NO:3所示核苷酸序列设计正向寡核苷酸序列和反向寡核苷酸序列；
[0015](3)将所述的正向寡核苷酸序列和反向寡核苷酸序列进行退火反应形成双链DNA；
[0016](4)将所述双链DNA连入线性化的CRISPR/Cas9载体骨架，即得所述基因敲除载体。
[0017]可选的，所述正向寡核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示，所述反向寡核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示。
[0018]其中，SEQ ID NO:1所示基因序列为：tctgtgagcctagtggatgtgaagccaaaaataaa；SEQ ID NO:2所示基因序列为：ATTAGCACCAAGATTTCTGTCACCAAACGGTCTGGACAGAAGTAAAGAG；其中，SEQ ID NO:3所示基因序列为：GGACAGAAGTAAAGAGGTAT；SEQ ID NO:4所示基因序列为：TAGGACAGAAGTAAAGAGGTAT；SEQ ID NO:5所示基因序列为：AAACATACCTCTTTACTTCTGT。
[0019]可选的，步骤(4)中，所述基因敲除载体按照如下方式连接：线性化的CRISPR/Cas9载体质粒0.5μL，双链DNA 2μL，2
×
Solution I 2.5μL；
[0020]可选的，所述线性化的CRISPR/Cas9载体质粒浓度为50ng/μL，所述的双链DNA的浓度为100ng/μL，16℃反应2h。
[0021]优选的，所述CRISPR/Cas9载体质粒为p
‑
T7
‑
gRNA。
[0022]可选的，步骤(3)中，所述退火体系包括：所述正向寡核苷酸序列和反向寡核苷酸序列各为5μL；
[0023]可选的，所述正向寡核苷酸序列的浓度为10μmol/L，所述反向寡核苷酸序列的浓度为10μmol/L；
[0024]可选的，所述退火反应条件包括：95℃加热5min，自然冷却至室温。
[0025]本公开还提供了上述任意一项所述的基因敲除载体或上述任意一项所述的构建方法构建得到的基因敲除载体在制备增强斑马鱼抗病毒免疫功能的药物中的用途。
[0026]本公开技术方案，具有如下优点：
[0027]本公开提供的基因敲除载体能够精准敲除编码斑马鱼PKR链接区的基因片段，特别是能够精本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基因敲除载体，其特征在于，所述基因敲除载体包括CRISPR/Cas9载体骨架与连接在所述载体骨架上的一段DNA片段，所述DNA片段能够特异性靶向编码斑马鱼PKR链接区的基因片段。2.根据权利要求1所述的基因敲除载体，其特征在于，所述DNA片段能够特异性靶向斑马鱼PKR基因中的第11位外显子。3.根据权利要求2所述的基因敲除载体，其特征在于，所述DNA片段能够特异性靶向斑马鱼PKR基因中的第10位和第11位外显子。4.根据权利要求3所述的基因敲除载体，其特征在于，所述DNA片段的序列如SEQ ID NO:3所示。5.根据权利要求1～4中任意一项所述的基因敲除载体，其特征在于，所述CRISPR/Cas9载体骨架为Cas9 mRNA体外转录载体Psp6
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2Snls
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spCas9和/或gRNA克隆与体外转录载体骨架p
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T7
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gRNA。6.权利要求1～5中任意一项所述基因敲除载体的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)基于斑马鱼PKR基因中的第10位和第11位外显子序列及其后部分内含子序列，设计打靶位点，所述10位外显子序列如SEQ ID NO:1所示，所述第11位外显子序列如SEQ ID NO:2所示，所述打靶位点的靶序列如SEQ ID NO:3所示；(2)根据SEQ ...

【专利技术属性】
技术研发人员：胡有生，陈春香，贾鹏，饶泽昌，肖星洋，宋凯怡，
申请(专利权)人：南昌大学抚州医学院，
类型：发明
国别省市：