【技术实现步骤摘要】
一种牛CART基因真核过表达载体的构建与应用
[0001]本专利技术涉及基因表达载体构建与应用
，具体为一种牛CART基因真核过表达载体的构建与应用。
技术介绍
[0002]可卡因
‑
苯丙胺调节转录肽(Cocaine
‑
and Amphetamine
‑
Regulated Transcript Peptide，CART)是一种在动物体内广泛分布的内源性神经肽，参与摄食调控、激素释放、药物依赖与卵泡发育等多种生物学功能。通常过表达载体只将基因的CDS区构建在载体上，细胞转录后的mRNA没有UTR区，存在无法研究miRNA对mRNAUTR调控的问题。
[0003]miRNA是一类由内源基因编码的长度约为22nt的非编码单链RNA，在动物中，多数情况下miRNA与mRNA的3
′
UTR不完全互补结合，从而阻碍该mRNA的翻译，并以此来调控基因表达。普通过表达载体只构建了CDS区，存在研究miRNA对mRNA 3
′
UTR的调控机
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种牛CART基因真核过表达载体的构建与应用，其特征在于：具体包括以下步骤：步骤一：利用PCR方法得到牛CART mRNA+UTR序列片段：
①
目的基因上下游引物分别加上pEX
‑
3载体上EcoRI和BamHI两侧同源序列，用于载体的亚克隆；
②
将oligo浓度溶解至50μmol/L，将分别取相同体积oligo至一1.5mL离心管，混合均匀，配成oligo mix；
③
用配制好的oligo mix进行第一轮PCR反应；
④
用oligo
‑
1和oligo
‑
20进行第二轮PCR反应，模板为第一轮PCR反应的产物；
⑤
反应条件与第一轮相同，第一轮PCR得到混有目的基因条带的非单一条带PCR产物混合物，再用第一轮的PCR产物为模板，通过第二轮PCR获得单一的目的基因条带；
⑥
PCR反应完成后，利用Agarose电泳并切胶回收CART mRNA+UTR基因片段；步骤二：目的基因CART mRNA+UTR克隆到载体pEX
‑
3中：
①
pEX
‑
3酶切并纯化；
②
CART mRNA+UTR与pEX
‑
3定向连接；
③
感受态细胞制备；
④
连接产物转化；
⑤
阳性克隆鉴定并测序验证；
⑥
正确重组质粒抽提；步骤三：CART mRNA+UTR在293T细胞中的过表达：
①
进行293T细胞的培养；
②
将pEX
‑3‑
CART mRNA+UTR重组过表达载体转染293T细胞。2.如权利要求1所述的一种牛CART基因真核过表达载体的构建与应用，其特征在于：所述pEX
‑
3酶切并纯化，具体包括
①
用EcoRI和BamHI对pEX
‑
3进行酶切，37℃酶切2h；
②
通过电泳方法用DNA凝胶回收试剂盒回收载体pEX
‑
3。3.如权利要求2所述的一种牛CART基因真核过表达载体的构建与应用，其特征在于：所述CART mRNA+UTR与pEX
‑
3定向连接，具体包括
①
利用Entry One Step Cloning Kit将扩增好的CART mRNA+UTR片段重组克隆到线性化的pEX
‑
3载体中；
②
使用移液器上下吹打数次，轻轻混匀各组分，置于37℃反应30min，反应完成后立即将反应管置于冰水浴中，冷却5min。4.如权利要求3所述的一种牛CART基因真核过表达载体的构建与应用，其特征在于：所述感受态细胞制备，具体包括
①
从经37℃培养16h的新鲜平板中挑取一个单菌落，转到含有100mL LB培养基的1L烧瓶中，于300rpm的旋转摇床上振摇培养3h，培养温度37℃；
②
在无菌条件下将细菌转移到一个无菌、一次性使用的、用冰预冷的50mL离心管中，在冰上放置10min，使培养物冷却至0℃；
③
于4℃，以4000rpm离心10min，回收细胞；
④
倒出培养液，将管倒置1min，使最后残留的痕量培养液流尽；
⑤
以10mL用冰预冷的0.1mol/L CaCl2重悬每份沉淀，放置于冰浴上；
⑥
于4℃，以4000rpm离心10min，回收细胞；
⑦
倒出培养液，将管倒置1min，使最后残留的痕量培养液流尽；
⑧
每50mL初始培养物用2mL用冰预冷的0.1mol/L、含20％甘油的CaCl2重悬每份细胞沉淀；
⑨
将细胞分装成小份，按照100μL/支，放于<...
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