一种CAR-NK细胞及其制备方法与应用技术

本发明专利技术涉及一种CAR

【技术实现步骤摘要】
一种CAR
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NK细胞及其制备方法与应用

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[0001]本专利技术属于肿瘤免疫治疗领域，具体提供了一种CAR
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NK细胞及其制备方法与应用。

技术介绍
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[0002]恶性肿瘤是威胁人类健康的第一大“杀手”，恶性肿瘤的诊治一直是目前国内外探索的热点和难点问题，尽管外科手术、放疗技术和新型化疗药物不断被研发、完善，但不同的恶性肿瘤都难以取得一个长久的预后，这使得抗肿瘤新方法的研究更加迫切和有意义。在已知的恶性肿瘤中，多发性骨髓瘤(multiple myeloma,MM)是一种骨髓浆细胞克隆增殖性疾病，MM发病人数占血液肿瘤患者总数的10％，是仅次于恶性淋巴瘤的第二常见的血液系统恶性肿瘤。骨髓瘤患者血、尿中出现单克隆免疫球蛋白或其片段，造成骨髓造血、肾脏、骨骼等相关靶器官功能损害，临床主要表现为贫血、骨痛和溶骨性破坏、肾功能不全、反复感染等。目前临床上，骨髓瘤治疗以化疗和干细胞移植为主，化学药物治疗副作用较大，严重影响患者生活质量，细胞供者、患者的年龄、移植后相关并发症如移植物抗宿主病、移植后复发等仍然是造血干细胞移植面临的重要问题。因此，迫切需要一种新的治疗方法来改善骨髓瘤患者的预后。
[0003]在新型肿瘤治疗方法的研究中，肿瘤免疫治疗越来越多地被人们关注，对抗肿瘤免疫和肿瘤微环境的研究，为肿瘤免疫治疗提供了新的研究基础，肿瘤免疫治疗包括过继免疫治疗和靶向药物治疗。在1988年，美国研究者Rosenberg等首次提出过继免疫治疗的概念，它是指将患者自身T淋巴细胞、自然杀伤细胞(NK细胞)等免疫细胞在体外培养扩增并激活，联合使用生长因子输注回患者体内，使得这些免疫效应细胞发挥杀伤肿瘤细胞的作用，从而达到治疗肿瘤的目标。尽管这种疗法在包括黑色素瘤在内的部分肿瘤治疗中取得了较好的效果，但是对于大多数恶性肿瘤却疗效不佳，主要是因为受到主要组织相容性复合物(Major histocompatibility complex，MHC)的制约，这使得T淋巴细胞直接识别杀伤肿瘤的效果大打折扣。在此背景下，具有高效特异性、持久性和杀伤活性特点的嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor，CAR)修饰T淋巴细胞进入了大家的视野。CAR的基本结构包括一个肿瘤相关抗原(tumor
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associated antigen,TAA)结合区(通常来源于单克隆抗体抗原结合区域的scFV段)，一个胞外铰链区(Hinge area)，一个跨膜区(Transmembrane region)和一个胞内免疫受体酪氨酸活化基序(Immunoreceptor tyrosine
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based activation motif,ITAM)。这种结构可以突破MHC的制约，且能够通过胞外表达的抗原结合域特异性靶向肿瘤细胞发动攻击，从而发挥高效而持久的抗肿瘤活性。
[0004]嵌合抗原受体经历了四代结构，第一代CAR结构简单，无共刺激信号域，导致T细胞无法被完全激活，表现为无法在体内扩增到满足临床需要的程度，疗效不理想；第二代CAR加入了一个共刺激结构域(CD28或4
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1BB)，显著提高了CAR
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T细胞的作用持续时间；第三代CAR则同时添加了两个共刺激结构域，使CAR
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T细胞在体内活性更强，但有研究提出三代CAR可能会造成T细胞对刺激做出反应的界限值降低，诱发更重的细胞因子释放综合征；第四代
CAR
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T细胞又被称为TRUCK(T
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cells redirected for universal cytokine killing)
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T细胞，含有一个活化的T细胞核因子转录相应元件，可以使CAR
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T细胞在肿瘤浸润范围内分泌特定的细胞因子来修饰肿瘤微环境，促进其他的免疫细胞参与免疫反应。目前的临床试验中，CD19 CAR
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T细胞在治疗B
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ALL患者时可达到80％以上的CR率，在B细胞淋巴瘤中反应率为52％
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83％，在CLL的治疗中也有一定的反应率。
[0005]然而，CAR
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T细胞治疗在带来令人满意的缓解率的同时，产生的相关不良反应也受到了目前临床治疗的关注，CAR
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T细胞疗法的毒副反应主要包括:1)插入突变：CAR
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T细胞治疗技术是在T细胞中插入一段外源性的DNA片段，有一定的导致第二肿瘤发生的风险；2)脱靶效应：即CAR
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T细胞在识别肿瘤特异性抗原、杀伤肿瘤细胞的同时，可能会波及微量表达相同抗原的正常组织，称为脱靶效应；3)炎症反应：CAR
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T细胞在抗原刺激下活化，分泌大量炎症因子，形成如细胞因子释放综合征、肿瘤溶解综合征等炎症反应；4)神经毒性；5)B细胞发育不全：是CD19 CAR
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T细胞治疗的预期结果，在杀伤肿瘤细胞的同时也杀伤正常的表达CD19的B细胞，从而导致B细胞功能不全甚至B细胞衰竭；6)移植抗宿主反应(graft versus
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host disease，GVHD)，据报道大约有10％～20％的急性淋巴细胞性白血病(acute lymphoblastic leukemia，ALL)患者对CD19导向的CAR
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T19存在原发耐药。上述不良反应中，细胞因子释放综合征(Cytokine release syndrome,CRS)最为常见，据报道CRS总发生率及严重CRS的发生率分别为58％
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97％和15％
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39％。其发生机制为CAR
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T细胞与抗原结合后引起广泛的免疫激活并释放大量的细胞因子从而导致全身炎症反应，也被称为细胞因子风暴，在临床上CRS的首发症状通常为发热，其他反应包括流感样症状、疲乏、头痛和肌痛。也可以影响到各个器官系统，出现恶心呕吐、腹泻、皮疹、缺氧、肺水肿、低血压、既往未见的心律失常、心功能不全、肝功能不全、凝血指标异常等，病情严重时甚至可出现危及生命的休克、毛细血管渗漏、需机械通气纠正的缺氧、恶性心律失常和终末器官功能障碍。
[0006]由于CAR
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T细胞存在诸多临床应用限制，使得研究人员开始将目光转向另一种免疫细胞——自然杀伤(natural killer，NK)细胞，K细胞属于大颗粒淋巴细胞，约占外周血淋巴细胞总数的10％～15％，NK细胞是天然免疫的重要组成成分，能够介导强大的抗肿瘤和抗病毒反应，NK细胞可释放IFN
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γ以及含有穿孔素和颗粒酶的溶酶体，用于杀伤靶细胞，因此NK细胞被认为是细胞毒性CD8
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T细胞的先天对应物，NK细胞的细胞毒活性与CD8
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T细胞最相似。相比于CAR
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T，CAR
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NK具有独特的应用优势，包括：1本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种靶向BCMA和CD5的双特异性嵌合抗原受体，其特征在于，所述嵌合抗原受体包括如下结构：S
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BCMA scFv
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CD5 scFv
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H
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TM
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C
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CD3ζ，其中BCMA scFv为靶向BCMA的抗原结合域；CD5 scFv为靶向CD5的抗原结合域；
“‑”
为连接肽或肽键；S为信号肽；H为铰链区；TM为跨膜结构域；C为共刺激信号分子；CD3ζ为胞内信号传导序列；BCMA scFv包括如SEQ ID NO:1
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3所示重链CDR区和SEQ ID NO:4
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6所示轻链CDR区；CD5 scFv包括如SEQ ID NO:7
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9所示重链CDR区和SEQ ID NO:10
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12所示轻链CDR区。2.根据权利要求1所述的双特异性嵌合抗原受体，其特征在于，所述BCMA scFv包括如SEQ ID NO:13所示重链可变区和SEQ ID NO:14所示轻链可变区。3.根据权利要求1所述的双特异性嵌合抗原受体，其特征在于，所述C...

【专利技术属性】
技术研发人员：沈健，葛永，刘正明，杨淑青，
申请(专利权)人：江苏蒙彼利生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：