一种针对腺病毒载体的单域重链抗体及其应用制造技术

本发明专利技术涉及一种针对腺病毒载体的单域重链抗体及其应用。所述单域重链抗体的VHH包括框架区FR和互补决定区CDR，单域重链抗体的VHH的氨基酸序列包括SEQ ID NO.8所示的氨基酸序列，其核苷酸序列包括SEQ ID NO.9所示的核苷酸序列。该单域重链抗体、及其核酸、载体及宿主细胞可用于检测腺病毒载体试剂、腺病毒治疗性抗体药物、以及腺病毒载体疫苗等的纯化和制备。该单域重链抗体能够在大肠杆菌中高效表达，特异识别腺病毒载体，具有特异性好等优点，为研发腺病毒治疗性抗体病药物和检测试剂方面提供广阔的应用前景。面提供广阔的应用前景。面提供广阔的应用前景。

【技术实现步骤摘要】
一种针对腺病毒载体的单域重链抗体及其应用


[0001]本专利技术属于生物医学与分子生物学领域，尤其涉及一种针对腺病毒载体的单域重链抗体及其应用。

技术介绍

[0002]腺病毒(adenovirus，Ad)属于腺病毒科，主要从五大类脊椎动物中提取，其中包括鸟类、哺乳动物、爬行动物、两栖动物和鱼类中，腺病毒的壳体直径为70
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90nm，无包膜、线状双链DNA病毒，由外部的衣壳蛋白和内部遗传物质组成。病毒DNA被包裹于蛋白质外壳内，壳体含六邻体(hexon)、五邻体(penton，base)和纤突(fiber)三种主要的蛋白质，同时还有四种次要的衣壳蛋白IIIa，VI，VIII和IX。腺病毒可以承载外源基因，作为基因递送载体应用于疫苗研发。其优势包括：有多种血清型可供选择，至今已从不同物种中分离鉴定的腺病毒有100多个型别，分为7个亚群(A
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G)；无需免疫佐剂，同时可以很好的激发机体的天然免疫反应，使用时较为方便；宿主范围较广，对人的致病性较低，与人类基因组同源等。
[0003]自从发现人类腺病毒之后，研究人员经过长时间的研究，从狗、老鼠、黑猩猩以及其他哺乳动物中已分离出了非人类腺病毒。到20世纪60年代末，人们在培养腺病毒过程中发现它是可以进行重组的，这为腺病毒作为基因载体奠定了基础。随着研究的深入，发现腺病毒载体具有诸多优势，使其成为基因治疗的首选载体，包括：(1)可以通过DNA重组技术对腺病毒的基因组进行编辑；(2)重组腺病毒可以进行扩增和纯化，可广泛应用于临床试验；(3)重组病毒比较稳定，病毒基因组不会快速重排；(4)腺病毒可以在HEK293A细胞中进行转录和表达，并可进行包装，复制出大量高滴度病毒，非常适用于基因治疗；(5)腺病毒载体的安全性较高，迄今为止，在进行的所有基因治疗临床试验中，腺病毒载体使用率达到了25％左右。
[0004]当腺病毒被用作疫苗载体时，在研究过程中需要注意它在人类中是否普遍存在。预先存在的免疫力将降低疫苗的有效性。研究发现，全球最普遍的腺病毒载体人腺病毒血清型HAd2和HAd5在临床研究中显示出不同的结果，大约80％的人口具有针对HAd5的中和抗体。因此，科学家们试图通过使用人群中低流行率的人类腺病毒血清型和开发其他物种(如黑猩猩和恒河猴)的腺病毒来制备腺病毒载体。
[0005]例如在D组腺病毒(如rAd26，rAd48，rAd24和rAd49)中，针对rAd26的中和抗体仅存在于南非和东南亚人群的个体中，而Ad5特异性中和抗体在所有地区都检测到非常高的水平。同样，研究结果表明，与接种Ad5疫苗的恒河猴相比，接种rAd26的恒河猴可以诱导更高水平的干扰素γ(IFN
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γ)、白细胞介素
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1受体激动剂(IL
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1RA)、IL
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6和诱导蛋白
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10(IP
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10)细胞因子，因此rAd26可以在疫苗研发领域发挥更好的作用。
[0006]除了研究人类腺病毒的使用外，研究人员还从非人类物种中分离出腺病毒，构建并执行临床应用。应用来自非人类物种的腺病毒的主要目的是避免对人类腺病毒血清型的现有免疫力。由非人类腺病毒引起的疾病是物种特异性的，因此这些病毒不会伤害人类。研究表明，当黑猩猩腺病毒(ChAd3，ChAd6，ChAd7，ChAd63和ChAd68)用于小鼠，非人灵长类动
物和人类的临床试验时，这些腺病毒载体可以逃避人类腺病毒血清型的特定免疫力。这些结果使ChAd63成为基因转移应用的良好候选者。
[0007]新型冠状病毒(2019
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nCoV)感染的爆发对全球公共卫生构成严重威胁，接种疫苗是预防病毒感染的有效手段。在来自不同国家的科研人员的努力下，已经开发出编码SARS
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CoV
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2主要抗原的腺病毒载体疫苗，如Ad5，rAd26和ChAdOx1，并且已经在临床试验中。
[0008]单域抗体(single domain antibody，sdAb)，也可以称作单域重链抗体，只有一个重链可变区结构域，被称做VHH，可以识别和结合抗原，具有与完整的常规IgG相同的结合活性。
[0009]目前，尚未有针对腺病毒载体的单域抗体的报道。

技术实现思路

[0010]鉴于现有技术所存在的问题，本专利技术提供一种针对腺病毒载体的单域重链抗体及其氨基酸序列，同时提供该单域重链抗体的DNA编码序列，含有该编码的载体、宿主细胞，并提出该单域重链抗体VHH在制备诊断试剂和治疗药物中的应用，以及基于该单域重链抗体的腺病毒免疫亲和纯化方法。本专利技术提供的单域重链抗体具有特异性好、表达量高等优点。
[0011]本专利技术解决上述技术问题的技术方案如下：
[0012]本专利技术提供一种针对腺病毒载体特异性的单域重链抗体，所述单域重链抗体的VHH包括框架区FR和互补决定区CDR；
[0013]所述框架区FR包括FR1、FR2、FR3和FR4；FR1的氨基酸序列包括SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列，FR2的氨基酸序列包括SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列，FR3的氨基酸序列包括SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列，FR4的氨基酸序列包括SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列；
[0014]所述互补决定区CDR包括CDR1、CDR2和CDR3，CDR1的氨基酸序列包括SEQ ID NO.5所示的氨基酸序列，CDR2的氨基酸序列包括SEQ ID NO.6所示的氨基酸序列，CDR3的氨基酸序列包括SEQ ID NO.7所示的氨基酸序列。
[0015]采用上述技术方案的有益效果包括：本专利技术将腺病毒载体rAd26和ChAd63免疫成年、健康双峰驼，随后利用该骆驼外周血淋巴细胞建立了针对腺病毒载体rAd26和ChAd63的单域重链抗体VHH基因库，试验中将腺病毒载体rAd26包被在酶标板上，利用噬菌体展示技术筛选单域抗体基因库，从而获得了针对腺病毒载体rAd26的特异性单域抗体基因，将此基因连接表达载体，转化至大肠杆菌，从而建立了能在大肠杆菌中高效表达的单域抗体细菌菌株。所述单域抗体能够与腺病毒载体rAd26、ChAd63和Ad5特异性结合，为其临床检测治疗提供更好的应用前景。
[0016]本专利技术提供的单域重链抗体，与传统的抗体相比，单域抗体的相对分子量较小，具有更强的组织穿透能力。它具有良好的稳定性，可以在
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80℃条件下长时间储存，甚至可以承受高温，高压和极端pH环境。简单的分子结构使其更容易在酵母，大肠杆菌和其他微生物表达系统中大量表达，并且使其能够进行工业化的大规模生产。相比传统的抗体，单域抗体性能优越，不仅可以应用于诊断、治疗的实验，并且还有广阔的应用空间。
[0017]单域重链抗体的VHH的氨基酸序列除了包括FR1、FR2、FR3、FR4、CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列还可以包括其他的氨基酸序列，例如，为便于本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种针对腺病毒载体的单域重链抗体，其特征在于，所述单域重链抗体的VHH包括框架区FR和互补决定区CDR；所述框架区FR包括FR1、FR2、FR3和FR4；FR1的氨基酸序列包括SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列，FR2的氨基酸序列包括SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列，FR3的氨基酸序列包括SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列，FR4的氨基酸序列包括SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列；所述互补决定区CDR包括CDR1、CDR2和CDR3，CDR1的氨基酸序列包括SEQ ID NO.5所示的氨基酸序列，CDR2的氨基酸序列包括SEQ ID NO.6所示的氨基酸序列，CDR3的氨基酸序列包括SEQ ID NO.7所示的氨基酸序列。2.根据权利要求1所述单域重链抗体，其特征在于，所述单域重链抗体的VHH的氨基酸序列包括SEQ ID NO.8所示的氨基酸序列。3.一种核酸，其特征在于，编码权利要求1或2所述单域重链抗体。4.根据权利要求3所述核酸，其特征在于，核酸的核苷酸序列包括SEQ ...

【专利技术属性】
技术研发人员：包福祥，郝彦霞，程艺，付山，刘艳龙，张慧敏，敖可心，吴玘瑶，
申请(专利权)人：内蒙古农业大学，
类型：发明
国别省市：