PPARγ第166位苏氨酸磷酸化修饰单克隆抗体的制备方法及应用技术

本发明专利技术属于抗体制备的生物检测技术领域，涉及PPARγ第166位苏氨酸磷酸化修饰单克隆抗体及其制备方法和应用。所述的制备方法为使用磷酸化标记的抗原肽段偶连与KLH蛋白，形成免疫用抗原，通过免疫小鼠、生产杂交瘤细胞以及抗体亲和力筛选等步骤获得可识别PPARγ第166位苏氨酸磷酸化修饰的小鼠单克隆抗体。进一步地，通过在多种应用场景中测试该单克隆抗体的检测效果，确定了该单克隆抗体在实际研究及样本检测中的应用。本检测中的应用。

【技术实现步骤摘要】
hemocyanin)进行化学偶联，得到免疫用抗原；(2)利用步骤(1)中所述的抗原对小鼠进行免疫；(3)收集免疫后小鼠的脾脏细胞，与骨髓瘤细胞SP2/0进行融合；(4)利用ELISA的方法对(3)所得杂交瘤细胞进行初步筛选得到分泌阳性抗体的杂交瘤细胞株；(5)对步骤(4)所得杂交瘤细胞进行至少3次亚克隆，直至筛选出稳定分泌阳性抗体的杂交瘤细胞株进行扩大再培养并保存。(6)杂交瘤细胞分泌的阳性抗体使用Protein G亲和纯化柱进行纯化。
[0009]所述的合成多肽为一种PPARγ蛋白磷酸化抗体的抗原合成肽，所述抗原合成肽的氨基酸序列具有如SEQ ID NO.1所示的序列，磷酸化位点为PPARγ蛋白的第166位苏氨酸。
[0010]所述的小鼠免疫步骤为分步免疫法，即间隔14天为一个免疫周期，共免疫4次。
[0011]所述的骨髓瘤细胞SP2/0融合为化学融合法，即使用PEG-1500作为融合剂进行融合。
[0012]所述的亚克隆方法为有限稀释法。
[0013]所述的亲和纯化法为Protein G亲和纯化柱纯化。
[0014]本专利技术所制备的单克隆抗体可应用于所有哺乳动物细胞、组织器官(含人临床样本)中PPARγ第166位苏氨酸磷酸化的检测。适用的应用场景包括：Western blotting、ELISA、免疫组化、免疫荧光、流式细胞术以及免疫沉淀等免疫学分析手段。可用于检测的样本包括：哺乳动物(包括人)细胞裂解液，组织石蜡/冰冻切片，活细胞或固定化细胞以及哺乳动物体液(血液、淋巴液、及组织液等)。
[0015]本专利技术所制备的杂交瘤细胞可用于单克隆抗体的生产。
附图说明
[0016]图1为小鼠最后一次免疫后的血清效价(图1.B)；最终定株的杂交瘤细胞分泌抗体的亲和力(图1.C)；制备获得单克隆抗体的识别特异性检测(图1.A)；
[0017]图2为使用制备获得小鼠单克隆抗体进行免疫组化检测；
[0018]图3为使用制备获得的小鼠单克隆抗体进行Western blotting检测。
具体实施方式
以下结合实例对本专利技术的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本专利技术，并未用于限定本专利技术的范围。
[0019]实施例1：制备分泌特异性识别PPARγ第166位苏氨酸磷酸化修饰的单克隆抗体的杂交瘤细胞株：(1)免疫用抗原：合成磷酸化多肽，氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；其中，对应苏氨酸位点被化学法磷酸化修饰；将磷酸化多肽与KLH偶联，得到免疫用抗原；(2)免疫程序：采用6周龄雌性BALB/c小鼠作为免疫动物，免疫剂量为200μg/只，经皮下多点注射免疫；每隔14天对小鼠进行一次免疫，共免疫3次；在融合前3天进行最后一次腹腔冲击作为加强免疫，融合当天取脾细胞；
(3)饲养层准备：融合前一天取正常小鼠腹水细胞作为饲养层细胞，铺于孔板或皿中，准备培养融合后细胞；(4)细胞融合：取对数生长期的骨髓瘤细胞SP2/0与步骤(2)中所得脾细胞分别计数后1：5混合，在PEG-1500的溶剂中进行细胞融合，融合后在含HAT的培养液中作选择培养，7天后可更换含HT培养液，一段时间后可更换为不含HAT及HT的正常培养基；(5)分泌特异性抗体杂交瘤细胞的筛选：当利用间接ELSIA的方法，以10μg/mL包被抗原，4℃孵育过夜。收取杂交瘤细胞上清进行检测，以最终吸光度与空白孔有显著性差异者所对应细胞为分泌目的抗体的杂交瘤细胞；(6)利用Dotblot对步骤(5)初步筛选测到的杂交瘤细胞分泌抗体进行特异性识别的检测；(7)杂交瘤细胞的亚克隆培养：利用有限稀释法对步骤(6)所得杂交瘤细胞进行至少3次亚克隆，同样利用间接ELSIA法检测，直至得到稳定分泌特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞为止。(8)杂交瘤细胞的保存：在液氮中保存。
[0020]实施例2：检测PPARγ第166位苏氨酸磷酸化修饰的单克隆抗体的纯化：(1)小鼠预处理：提前3～7天对8周龄健康BALB/c小鼠进行腹腔注射石蜡油预处理，500μL/只；(2)细胞培养：对[0019]实施例1来源的稳定分泌特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞进行放大培养至细胞数目达到0.5～1
×
107个，制备成1～2
×
107个/mL细胞悬液，注射至小鼠腹腔；(3)抗体纯化及纯度测定：经步骤(2)处理后小鼠腹部7～10天后明显胀大，采集腹水，利用Protein G亲和层析对腹水中抗体进行纯化，利用SDS-PAGE的方法对抗体的纯度进行鉴定。(4)单克隆抗体亲和力的测定：利用间接ELSIA法对步骤(3)中纯化获得的单克隆抗体进行亲和力测定，具体方法如下：分别以0.5、1、2μg/mL浓度的将抗原多肽包被于ELISA板上，100μL/孔，4℃孵育过夜；第二天用0.5％PBST对ELISA板进行Washing，共计2次，此步骤可去除未吸附多肽；随后，以2％(w/w)BSA溶液对ELISA板进行封闭，每孔200μL，37℃孵育2h；进一步地，用0.5％PBST对ELISA板进行Washing，清洗3次后，加入适量稀释比例的单克隆抗体，37℃孵育1h；进一步地，经0.5％PBST洗3次后的ELISA板进行二抗标记；最后，用TMB显色法对信号进行放大和展示，以此计算单克隆抗体亲和力。
[0021]实施例3(应用实例)：此部分结合说明书附图进行说明：(1)所述的该单克隆抗体的应用场景包括：Western blotting、ELISA、免疫组化、免疫荧光、流式细胞术以及免疫沉淀等免疫学分析手段。例如，图1.A所示，该抗体可用于Dot blotting；又如图1.C所示，该抗体可用于ELISA检测；再如图2所示，该抗体可用于免疫组化检测；最后，图3所示，该抗体可用于Western blotting检测。(2)以上检测样本包含：哺乳动物(包括人)细胞裂解液，组织石蜡/冰冻切片，活细胞或固定化细胞等。
[0022]以上实施例进一步说明本专利技术的内容，但不应理解为对本专利技术的限制。对于本领域的技术人员来说，在不背离本专利技术精神和实质的情况下对本专利技术方法、步骤或条件所做的修改和替换，均属于本专利技术的范围。
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种单克隆抗体，其特征在于，该抗体可特异性识别PPARγ蛋白第166位苏氨酸磷酸化修饰的单克隆抗体。2.一种杂交瘤细胞，其特征在于可持续稳定的分泌权利要求1中所述的抗体。3.PPARγ蛋白第166位苏氨酸磷酸化修饰的单克隆抗体与其杂交瘤细胞的制备方法。4.用于制备PPARγ蛋白第166位苏氨酸磷酸化修饰的单克隆抗体所使用的磷酸化肽段为KGFFRR(p-T)IRLKLIYDRC及其应用，序列见序列表SEQ ID NO.1所示。5.PPARγ蛋白第166位苏氨酸磷酸化修饰的单克隆抗体的应用。6.根据权利要求5中的应...

【专利技术属性】
技术研发人员：沈萍萍，杨南飞，蔡成洁，
申请(专利权)人：南京大学，
类型：发明
国别省市：