本发明专利技术公开了一种基于高通量测序对TCRβ进行定量的方法，包括如下步骤：使用Trizol裂解样本，在裂解样本中加入外参细胞裂解液；提取样本和外参细胞的总RNA；利用TCRβ的C端特异性引物进行反转录；在反转录产物中加入模板；使用一组优化了序列组成和使用浓度的多重PCR引物构建TCRβ的高通量测序文库，并进行测序；利用2轮外参数据对样本中的TCRβ进行定量。本发明专利技术通过加入外参细胞，可对样本的T细胞总数进行有效估计；通过使用优化了序列组成和使用浓度的多重PCR引物，可更好的减少多重引物相互之间的干扰和扩增偏倚；通过加入模板，可帮助TCR高通量测序数据的校正和标准化，最后获得精准而真实的TCRβ库分布。后获得精准而真实的TCRβ库分布。后获得精准而真实的TCRβ库分布。
【技术实现步骤摘要】
一种基于高通量测序对TCR β
进行定量的方法
[0001]本专利技术涉及生物
，特别是涉及一种基于高通量测序对TCR β进行定量的方法。
技术介绍
[0002]T细胞受体(T cell receptor，TCR)是T细胞表面的特异性受体，负责识别由主要组织相容性复合体(MHC)所递呈的抗原，并介导免疫应答。绝大多数T细胞是α，β
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T细胞(约占T细胞总数的90％～95％)，由高度多样化的α亚基和β亚基构成，均由胚系基因于胸腺中进行重排而成。成熟的T细胞迁移至外周，形成了一个多样性极其丰富的T细胞受体库(T cellreceptor repertoire)，决定着机体对环境变化的适应形式和能力。TCR的多样性来源于V(D)J基因片段的重组，同时在重组过程中V
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J、V
‑
D和D
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J的连接处经常有核苷酸(非模板)的随机插入或删除，这极大地提高了TCR的多样性。T细胞受体B亚基上的互补决定区3(complementarities determining region 3，CDR3)是TCR上十分重要的区域，这一区域对抗原肽有着最强的结合能力，也是多样性最高的区域，最能代表TCR的多样性。因此，研究者们大多通过研究T细胞受体β链的CDR3(TCR β CDR3)的多样性来研究T细胞受体库的多样性。随着高通量测序技术的发展，研究者们开发了T细胞受体测序技术(TCR
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seq)，该技术可对样品中所有的TCR进行测序分析，获得所有T细胞受体的遗传信息，全面揭示T细胞受体库的复杂性和多样性。但是由于T细胞受体库测序数据存在扩增偏倚和测序错误问题，导致以往研究估计T细胞受体的群体特性普遍存在偏差。而且我们发现T细胞受体库深度测序过程中，测序错误对T细胞库多样性的估计会产生很大影响。
技术实现思路
[0003]鉴于以上所述现有技术的缺点，本专利技术的目的在于提供一种基于高通量测序对TCR β进行定量的方法，本方法可对样本中的TCR β进行定量，适用于涉及免疫学的生物医学领域的研究。
[0004]为实现上述目的及其他相关目的，本专利技术提供一种基于高通量测序对TCR β进行定量的方法，包括如下步骤：
[0005](1)使用Trizol裂解样本，在裂解样本中加入固定数目的外参细胞裂解液；
[0006](2)提取样本和外参细胞的总RNA；
[0007](3)利用TCR β的C端特异性引物进行反转录；
[0008](4)在反转录产物中加入固定数目的模板；
[0009](5)使用一组优化了序列组成和使用浓度的多重PCR引物构建TCR β的高通量测序文库；(或者：以SEQ ID NO.3
‑
25所示序列为多重PCR引物，所述多重PCR引物的浓度进行了优化，进行多重PCR，胶回收PCR产物)
[0010](6)使用高通量测序平台进行测序；
[0011](7)利用2轮外参数据对样本中的TCR β进行定量。
[0012]进一步，步骤(1)中，所述外参细胞为TCR序列与样本中TCR序列不同的细胞；优选地，所述外参细胞为2B4杂交瘤细胞，但不限于2B4杂交瘤细胞，只要其TCR序列与样本中TCR序列不同，皆可用作于外参细胞；本专利技术实施例中使用的2B4杂交瘤细胞数目为200个，具体外参细胞数目可根据样本中T细胞数量进行调整。
[0013]进一步，步骤(2)中，总RNA提取的方法为Trizol法，但不仅限于Trizol法。
[0014]进一步，步骤(3)中，TCR β的C端特异性引物为TRBC，其序列如SEQ ID NO.1所示，但不局限于SEQ ID NO.1引物，本领域技术人员可以根据实际需要进行设计使用。
[0015]进一步，步骤(3)中，利用TCR β的C端特异性引物进行反转录的步骤如下：
[0016]①
取0.1ug步骤(2)的RNA、1ul引物TRBC(10uM)、其余为水，配制成12ul的反应体系，然后于PCR仪中72℃孵育3min，迅速冰上5min；
[0017]②
将步骤
①
所得产物、4ul 5X first strand buffer、2ul dNTPs、1ul RNA酶抑制剂、1ul RevertAid逆转录酶，配制成20ul的反应体系，然后于PCR仪中42℃孵育60min，70℃孵育10min。
[0018]进一步，步骤(4)中，所述模板有23条，序列如SEQ ID NO.26
‑
48所示。本专利技术的模板序列由V基因(V gene)、3个长度为6的分子条形码(BC)、D基因(D gene)、J基因(J gene)和C基因(C gene)构成，体现了TCR β的序列特点。具体的，在V基因和C基因中包含扩增引物结合的位点。由于有功能的V基因只有23个，因此本专利技术用不同的V基因设计合成了23条模板序列，该序列的长度为366bp。其中分子条形码的长度不局限于6个，本领域技术人员可以根据实际需要进行自行调整。
[0019]进一步，步骤(5)中，所述多重PCR的引物的序列如SEQ ID NO.3
‑
25所示，SEQ ID NO.3
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25序列添有高通量测序接头；
[0020]反向引物的序列如SEQ ID NO.2所示：
[0021]CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAG<barcode>AGACCTTGGGTGGAGTCAC。
[0022]序列SEQ ID NO.2
‑
25中，接头序列1：CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAG(SEQ ID NO.49)和接头序列2：CCTCTCTATGGGCAGTCGGTGAT(SEQ ID NO.50)为Ion PGM平台的接头序列，具体可以根据不同的高通量测序平台选择不同的接头序列。
[0023]进一步，步骤(5)中，多重PCR反应体系共50ul，包括以下反应组分：25ul mPCR预混液、5ul正向引物(FW
‑
primer mix)、5ul反向引物(RW
‑
primer)、lul Template mix、5ul cDNA、9ul水。
[0024]其中正向引物(FW
‑
primer mix)由如SEQ ID NO.3
‑
25所示的序列组成，SEQ ID NO.3
‑
25所示的序列的比例依次为1∶2∶6∶6∶2∶2∶6∶2∶6∶6∶1∶2∶2∶6∶6∶6∶6∶1∶1∶2∶1∶2∶2。
[0025]可选地，多重PCR反应程序为：95℃预变性10min；95℃变性30s，59℃退火90s，72℃延伸90s，循环35次；最后72℃后延伸10min。
[0026]进一步，步骤(6)本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种基于高通量测序对TCR β进行定量的方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)使用Trizol裂解样本，在裂解样本中加入固定数目的外参细胞裂解液；(2)提取样本和外参细胞的总RNA；(3)利用TCR β的C端特异性引物进行反转录；(4)在反转录产物中加入固定数目的模板；(5)使用一组优化了序列组成和使用浓度的多重PCR引物构建TCR β的高通量测序文库；(6)使用高通量测序平台进行测序；(7)利用2轮外参数据对样本中的TCR β进行定量。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(1)中，所述外参细胞为TCR序列与样本中TCR序列不同的细胞。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述外参细胞为2B4杂交瘤细胞。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(2)中，总RNA提取的方法为Trizol法。5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(3)中，TCR β的C端特异性引物为TRBC，其序列如SEQ ID NO.1所示；步骤(3)中，利用TCR β的C端特异性引物进行反转录的步骤如下：
①
取0.1ug步骤(2)的RNA、1ul引物TRBC(10uM)、其余为水，配制成12ul的反应体系，然后于PCR仪中72℃孵育3min，迅速冰上5min；
②
将步骤
①
所得产物、4ul 5X first strand buffer、2ul dNTPs、1ul RNA酶抑制剂、1ul RevertAid逆转录酶，配制成20ul的反应体系，然后于PCR仪中42℃孵育60min，70℃孵育10min。6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(4)中，所述模板有23条，序列如SEQ ID NO.26
‑
48所示；和/或，步骤(5)中，所述多重PCR引物的序列如SEQ ID NO.3
‑
25所示，，SEQ ID NO.3
‑
25序列添有高通量测序接头，反向序列如SEQ ID NO.2所示。和/或，步骤(5)中，多重PCR反应体系共50ul，包括以下反应组分：25ul mPCR预混液、5ul正向引物(FW
‑
primer mix)、5ul反向引物(RW
‑
primer)、1ul Template mix、5ul eDNA、9ul水。其中正向引物(FW
‑
primer mix)由如SEQ ID NO.3
‑
25所示...
【专利技术属性】
技术研发人员：万瑛，倪青山，于海礼，韩清娟，邹丽云，曾聪，黄毅，陈钢，
申请(专利权)人：中国人民解放军陆军军医大学，
类型：发明
国别省市：
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