检测标本中CKAP4试剂的应用及膀胱癌检测试剂盒制造技术

本发明专利技术公开了一种检测标本中CKAP4试剂的应用及膀胱癌检测试剂盒。CKAP4不仅高表达于膀胱癌细胞系和它们分泌的外泌体中，更重要的是，在临床上CKAP4显著高表达于膀胱癌患者的尿液外泌体中，而在前列腺癌、肾细胞癌等泌尿系统癌症、泌尿系统炎症、以及健康供体的尿液外泌体中表达量很低，具有显著的特异性。因此，基于尿液外泌体CKAP4的检测手段是一种廉价、简捷、可满足多次检测的非侵入性的液体活检方法，特别适用于膀胱癌患者的诊断和复发监测。特别适用于膀胱癌患者的诊断和复发监测。特别适用于膀胱癌患者的诊断和复发监测。

【技术实现步骤摘要】
检测标本中CKAP4试剂的应用及膀胱癌检测试剂盒


[0001]本专利技术属于肿瘤分子生物学
，涉及一种检测标本中CKAP4试剂的应用及膀胱癌检测试剂盒。

技术介绍

[0002]膀胱癌是一种发病于膀胱上皮的恶性泌尿系统疾病，据2020年的数据显示，全球范围内膀胱癌的发病率和死亡率都排在前10，每年有57.3万新发病例和21.3万死亡病例。其中，大约75％的为非肌层浸润性膀胱癌，25％为肌层浸润性膀胱癌。然而，无论是否发生肌层浸润，膀胱癌的一个重要特征是其高复发性，并且膀胱癌的转移会引起疾病的快速进展，并在短时间内致使患者死亡。因此，建立快速、简便、廉价、可满足高频率检测要求的方法，是应对膀胱癌复发和改善治疗效果的一项关键技术。
[0003]在现有的检测方法中，膀胱镜组织活检是临床诊断的金标准，这项技术是将膀胱镜经尿道插入膀胱，直接观察膀胱和尿道内病变情况，并切取疑似病灶组织用于病理诊断的侵入式有创检查方法，准确率高。然而，这种侵入式的检查方法不仅需要医生具有丰富的操作经验，并且并发症多，容易遗漏平坦型尿路上皮原位癌，患者的接受程度较低，难以满足大规模推广的需求。基于超声、CT、MRI等技术的影像学检查是一类在临床上广泛使用的检测手段。对于膀胱癌，尤其是早期的非浸润性膀胱癌或术后复发的微小病灶，该类影像学检测手段常因仪器分辨率的限制而导致错诊、漏诊现象，具有较大的局限性。另外，目前临床使用的基于尿液的无创检测技术如尿液脱落细胞学、核基质蛋白22(NMP22)及染色体荧光原位杂交(FISH),其灵敏度和特异性等性能指标难以满足临床诊断的需要，尤其对低级别膀胱癌检测灵敏度较差，更无法实现膀胱癌的早期筛查。
[0004]外泌体是由细胞分泌的尺寸在30
‑
100nm的微小囊泡，携带了众多细胞内部的生物信息，能够准确反映其来源细胞的分子生物学特征。由于肾小球滤过的尺寸限制，血液中的外泌体通常无法直接进入泌尿系统，因此尿液中的外泌体均来源于泌尿系统细胞，能够有效地排除其他全身性细胞分泌的外泌体的干扰。研究表明，相比于正常细胞，癌细胞由于其增殖旺盛，具有更强的外泌体分泌能力，能够将更大量包含有细胞生物信息的外泌体分泌到细胞外环境。在分离纯化方面，由于外泌体本身的尺寸效应，分子量小的无机盐、生物小分子、杂质蛋白和分子量较大的脱落细胞等干扰性杂质会被极大地排除在外，因此膀胱癌作为一种发病于泌尿系统的疾病，通过患者尿液外泌体生物特征实现膀胱癌的无创检测是一种极具前途的新型分子检测手段。
[0005]目前，在外泌体生物标志物的研究方面，TACSTD2、AAT、Filamin
‑
A和H2B1K被发现在肿瘤衍生的外泌体样本中含量较高，但是通过特异性抗体印迹技术检测，发现信号较差，仍无法达到各组患者与对照样本之间的统计学差异，加上检测灵敏度的不足，使其难以转化为临床应用成果。因此，发现可用于膀胱癌临床检测的尿液外泌体生物标志物具有显著的应用优势与市场需求。

技术实现思路

[0006]本专利技术公开了一种具有膀胱癌特异性的蛋白质分子CKAP4，该分子不仅高表达于膀胱癌细胞系及其外泌体中，而且在膀胱癌患者尿液的外泌体中也特异性高表达。本专利技术还发现CKAP4经由外泌体调控细胞表面力学性质，从而促进细胞的迁移和在小鼠体内的转移，强调了CKAP4在膀胱癌外泌体中的重要作用。
[0007]本专利技术的首要目的是提供一种检测标本中CKAP4试剂的应用，用于制备膀胱癌诊断制剂，所述的标本包括：组织、细胞、细胞外泌体、血液、尿液和尿液外泌体中的至少一种。
[0008]进一步地，CKAP4在膀胱癌患者标本中表达量要高于健康人、泌尿系统炎症，或者其他癌症患者。
[0009]进一步地，所述的检测标本中CKAP4试剂包括检测标本中CKAP4蛋白含量的试剂。
[0010]进一步地，所述的检测标本中CKAP4试剂还包括提取标本中CKAP4蛋白的试剂。
[0011]进一步地，所述的标本包括：尿液和尿液外泌体中的至少一种，尤其是尿液外泌体。
[0012]本专利技术的第二个目的是提供一种膀胱癌检测试剂盒，包括检测标本中CKAP4蛋白含量的试剂。
[0013]进一步地，所述的试剂盒，还包括提取标本中CKAP4蛋白的试剂。
[0014]所述的标本包括：组织、细胞、细胞外泌体、血液、尿液和尿液外泌体中的至少一种。
[0015]进一步地，所述的标本包括：尿液和尿液外泌体中的至少一种，尤其是尿液外泌体。
[0016]本专利技术还提供CKAP4在通过外泌体的转运调控细胞表面力学性质，维持细胞表面由中心到边缘的高硬度梯度研究中的应用。这种特性能够显著促进膀胱癌的转移。
[0017]在临床上，本专利技术通过收集不同等级的膀胱癌患者治疗前后的晨尿样本，采用超高速离心法提取外泌体，经werstern blot验证外泌体中CKAP4的表达情况，确定了CKAP4在膀胱癌患者尿液外泌体中的特异性高表达，经手术切除肿瘤后的样本中表达量显著降低，而在泌尿系统炎症患者和健康人供体的尿液外泌体中CKAP4表达量很低。在本专利技术涉及的32例样本中，基于外泌体CKAP4检测的敏感性、特异性、准确度分别为93.8％(16例膀胱癌阳性患者中检出15例)、100％(16例非膀胱癌患者阴性样本中均未检测出CKAP4表达)、96.8％(所有32例样本中31例符合检测预期)(如图7)，其优良的选择性与灵敏度适用于临床上的检测标准。
[0018]所述的检测膀胱癌的外泌体蛋白质分子还包括如下应用：
[0019](1)基于膀胱癌患者尿液中外泌体CKAP4的临床检测手段，如检测试纸、试剂盒、器件、仪器等。
[0020](2)在制备膀胱癌治疗载体试剂中的应用。
[0021](3)在研究膀胱癌细胞与正常细胞的差异性中的应用。
[0022](4)在研究膀胱肿瘤活体成像中的应用。
[0023]与现有技术相比，本专利技术的优点在于：
[0024]1、基于膀胱癌患者尿液中外泌体CKAP4的检测敏感性、特异性、准确度分别为93.8％、100％、96.8％，远远大于现有基于游离蛋白和脱落细胞的检测手段；
[0025]2、本专利技术收集到的外泌体可以来自于不同发病位点的膀胱癌细胞，能够反映患者发病部位的整体状况，避免膀胱镜等检测方法中可能发生的漏检状况；
[0026]3、本专利技术的检测手段能够很好地避免来自临床样本中较大的脱落细胞、沉淀、代谢产物的影响，同时可以避免无法去除的游离杂蛋白的影响；
[0027]4、本专利技术基于外泌体蛋白CKAP4的检测手段，能够被用于初次发病检测、随检等方面的应用。
[0028]上述优点使得所述外泌体CKAP4作为膀胱癌特异性识别分子探针，用于诊断和靶向治疗膀胱癌方面具有重要的潜力。
附图说明
[0029]图1：CKAP4在膀胱癌组织中的表达情况；
[0030]a)相比于正常组织，CKAP4在膀胱癌患者中高表达；其中，B本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.检测标本中CKAP4试剂的应用，其特征在于，用于制备膀胱癌诊断制剂，所述的标本包括：组织、细胞、细胞外泌体、血液、尿液和尿液外泌体中的至少一种。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，CKAP4在膀胱癌患者标本中表达量要高于健康人、泌尿系统炎症，或者其他癌症患者。3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的检测标本中CKAP4试剂包括检测标本中CKAP4蛋白含量的试剂。4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的检测标本中CKAP4试剂还包括提取标本中CKAP4蛋白的试剂。5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的标本包括：尿...

【专利技术属性】
技术研发人员：叶茂，谭蔚泓，孙星，李霞辉，
申请(专利权)人：湖南大学，
类型：发明
国别省市：