一种用于牛中常见艾美耳球虫检测和虫种鉴定的巢式PCR方法及试剂盒技术

本发明专利技术公开了一种用于牛中常见艾美耳球虫检测和虫种鉴定的巢式PCR方法及试剂盒。本发明专利技术采用牛的艾美耳球虫SSU rRNA基因作为检测靶序列，所述序列中具有保守区域和可变区域，相应扩增片段中包含多个单核苷多态性位点；本发明专利技术进一步通过设计巢式PCR引物，建立了牛中常见艾美耳球虫巢式PCR检测方法，可检测出不同的牛中常见艾美耳球虫，进行艾美耳球虫的虫种鉴定。采用本发明专利技术的检测方法能够最低检测到一个卵囊，其扩增效率高，检测灵敏，可以准确区分牛感染的不同艾美耳球虫，并确定引起发病的不同虫种，用于牛球虫病的精准防控。用于牛球虫病的精准防控。用于牛球虫病的精准防控。

【技术实现步骤摘要】
一种用于牛中常见艾美耳球虫检测和虫种鉴定的巢式PCR方法及试剂盒


[0001]本专利技术属于分子生物学
更具体地，涉及一种用于牛中常见艾美耳球虫检测和虫种鉴定的巢式PCR方法及试剂盒。

技术介绍

[0002]艾美耳球虫(Eimeria)是牛科动物中常见的肠道寄生虫，主要引起以急性肠炎和血便为主的牛球虫病，在2岁以内的犊牛感染率可高达到100％，而且具有高致死率，因此对畜牧业危害严重。目前，在我国牛中已发现的艾美耳球虫有13种，分别是椭圆艾美耳球虫(E.ellipsoidalis)、亚球形艾美耳球虫(E.subsperica)、邱氏艾美耳球虫(E.zuernii)、阿拉巴马艾美耳球虫(E.alabamensis)、牛艾美耳球虫(E.bovis)、加拿大艾美耳球虫(E.canadensis)、柱状艾美耳球虫(E.cylindrica)、奥博艾美耳球虫(E.auburnensis)、怀俄明艾美耳球虫(E.wyomingensis)，伊利诺斯艾美耳球虫(E.illinoisensis)、巴西艾美耳球虫(E.brasiliensis)、皮利他艾美耳球(E.pellita)和布克朗艾美耳球虫(E.bukidnonensis)。但是现今普遍认为牛艾美耳球虫和邱氏艾美耳球虫是对牛致病性最强的两个艾美耳球虫虫种，会引起肠道损伤，导致严重腹泻，甚至死亡。除了这两种球虫外，其他虫种是否具有致病性尚有争议。所以亟需可以准确区分牛感染的不同艾美耳球虫虫种的方法，以确定引起发病的虫种，同时也有助于牛球虫病的精准防控。
[0003]目前牛中常见艾美耳球虫的检测和虫种鉴定技术主要有两种，分别是形态学观察和PCR检测。牛中常见的艾美耳球虫虫种在卵囊大小、颜色和形状上具有一定差异，其中部分虫种通过形态学特征加以区分。已有研究者对不同的艾美耳球虫的卵囊和子孢子的形态学数据进行了测量和统计，为其他学者辨认鉴定虫种提供了重要参考。但是，基于形态学的检测和鉴定具有一定的主观性，易造成误判，且通常需要样本中包含大量卵囊，检测灵敏度低、耗时长。近年来，有学者建立了基于PCR的艾美耳球虫分子检测方法，这些方法几乎都是以艾美耳球虫属特异性的核糖体RNA基因的内转录间隔区(Internal Transcribed Spacer，ITS)为目标扩增序列，但不同艾美耳球虫的内转录间隔区的序列长度和多态性差异较大。因此采用艾美耳球虫属特异性的ITS通过PCR对不同虫种的扩增效率存在明显差异，因此采用同一扩增条件进行扩增时常导致无法对某些虫种有效扩增，即导致假阴性出现。而且，现有的艾美耳球虫ITS PCR扩增均为单轮PCR，检测灵敏度较低，无法准确检测卵囊量较低的样本，并且易造成非特异性的扩增。

技术实现思路

[0004]本专利技术要解决的技术问题是克服上述问题的缺陷和不足，提供一种用于牛中常见艾美耳球虫检测和虫种鉴定的巢式PCR方法及试剂盒。
[0005]本专利技术的第一个目的是提供一种用于牛中常见艾美耳球虫检测和虫种鉴定的PCR引物。
[0006]本专利技术的第二个目的是提供一种用于牛中常见艾美耳球虫检测和虫种鉴定的巢式PCR引物。
[0007]本专利技术的第三个目的是提供所述PCR、巢式PCR引物的应用。
[0008]本专利技术的第四个目的是提供一种用于牛的艾美耳球虫检测和虫种鉴定的方法。
[0009]本专利技术的第五个目的是提供一种用于牛中艾美耳球虫的检测和虫种鉴定的检测试剂盒。
[0010]本专利技术上述目的通过以下技术方案实现：
[0011]本专利技术提供一种用于牛中常见艾美耳球虫检测和虫种鉴定的PCR引物，所述引物设计位点位于牛的艾美耳球虫SSU rRNA高度保守区且其扩增片段中存在区分不同虫种的单核苷酸多态性位点。本专利技术采用的SSU rRNA序列来自于奥博艾美耳球虫基因18S rRNA序列，其登录号为AB769563.1。
[0012]SSU rRNA基因序列在牛常见艾美耳球虫中即具有保守区域，又具有可变区域(单核苷酸多态性位点)，通过针对其保守区域设计PCR引物，扩增的片段大小在牛感染的多种艾美耳球虫中无明显差异，且在同一扩增条件下对牛中常见艾美耳球虫扩增效率基本相同，假阴性低，相应扩增片段中仅包含多个单核苷多态性位点。由于不同虫种的扩增片段中具有特异性的单核苷酸多态性位点，因此根据这些多态性位点可以区分不同的虫种。
[0013]优选地，所述引物为巢式PCR引物，其退火温度为55～65℃；上、下游引物的T
m
值相差不超过2℃；PCR产物大小为300～1000bp；引物长度为15～30bp；GC含量为40～60％。
[0014]进一步优选地，所述引物为巢式PCR引物，采用第一轮PCR上游引物Eimeria
‑
F1、第一轮PCR下游引物Eimeria
‑
R1和第二轮PCR上游引物Eimeria
‑
F2、第二轮PCR下游引物Eimeria
‑
R2，其核苷酸序列依次如SEQ ID NO：1～4所示。本专利技术通过牛的艾美耳球虫SSU rRNA高度保守区设计的巢式PCR引物的特异性强、灵敏度高，可以更好区分不同虫种。
[0015]本专利技术提供一种用于牛的艾美耳球虫检测和虫种鉴定的方法，包括如下步骤：
[0016]S1.从待测粪便样品中提取DNA；
[0017]S2.以S1所述DNA为模板，采用所述PCR引物进行PCR或巢式PCR扩增；
[0018]S3.对步骤S2中扩增产物进行电泳检测，其中只要扩增出一条条带即为阳性样本，并把阳性样本进行测序分析，根据虫种特异性单核苷酸多态性位点上的碱基序列来鉴定待测样品的虫种。
[0019]优选地，所述巢式PCR第一轮扩增的反应体系为：1μL DNA、25μL 2
×
DreamTaq PCR Master Mix、1.25μL第一轮PCR上游引物和下游引物、2μL牛血清蛋白，最后加入去离子水至50μL；第二轮扩增的反应体系为：2μL第一轮PCR产物、25μL 2
×
DreamTaq PCR Master Mix、2μL牛血清蛋白，以及1.25μL第二轮PCR上游引物和下游引物，最后加入去离子水至50μL。
[0020]更优选地，采用的PCR引物浓度为10μM，牛血清蛋白浓度为10mg/ml。
[0021]优选地，所述巢式PCR第一轮与第二轮扩增程序相同均为：94℃预变性持续5分钟；94℃变性45秒，52℃退火30秒和68℃延伸30秒，一共循环该过程45次；最后，68℃延伸7分钟。
[0022]本专利技术提供上述引物在制备用于牛的艾美耳球虫检测和虫种鉴定试剂盒中的应用。
[0023]本专利技术还提供一种用于牛中艾美耳球虫的检测和虫种鉴定的检测试剂盒，包含上
述PCR引物。
[0024]优选地，所述检测试剂盒还包含PCR所需试剂阳性和阴性对照。
[0025]优选地，所述检测试剂盒还包含从待测本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于牛中常见艾美耳球虫检测和虫种鉴定的PCR引物，其特征在于，所述引物设计位点位于牛的艾美耳球虫SSU rRNA高度保守区且其扩增片段中存在区分不同虫种的单核苷酸多态性位点。2.根据权利要求1所述PCR引物，其特征在于，所述引物为巢式PCR引物，包括第一轮PCR上游引物Eimeria
‑
F1、第一轮PCR下游引物Eimeria
‑
R1和第二轮PCR上游引物Eimeria
‑
F2、第二轮PCR下游引物Eimeria
‑
R2，其引物的核苷酸序列依次如SEQ ID NO：1～4所示。3.权利要求1或2所述PCR引物在牛的艾美耳球虫检测和虫种鉴定中的应用。4.一种用于牛的艾美耳球虫检测和虫种鉴定的方法，其特征在于，包括如下步骤：S1.从待测粪便样品中提取DNA；S2.以步骤S1所述DNA为模板，用权利要求1或2所述PCR引物进行PCR或巢式PCR扩增；S3.对步骤S2中扩增产物进行电泳检测，其中只要扩增出一条条带即为阳性样本，并把阳性样本进行测序分析，根据虫种特异性单核苷酸多态性位点上的碱基序列来鉴定待测样品的虫种。5.根据权利要求4所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：肖立华，陈雪华，冯耀宇，郭亚琼，李娜，
申请(专利权)人：华南农业大学，
类型：发明
国别省市：