一种鳞球茎茎线虫的LAMP快速检测方法技术

本发明专利技术公开了一种鳞球茎茎线虫的LAMP快速检测方法，属于植物病害的分子生物学检测领域。包括以下步骤：1)以待测样品的DNA为模板，利用鳞球茎茎线虫的LAMP引物组进行LAMP扩增；2)根据是否发生特异性的扩增判断待测样品中是否含有鳞球茎茎线虫；其中，LAMP引物组包括一对外引物F3/B3，一对内引物FIP/BIP和一对环引物LF/LB，引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1

【技术实现步骤摘要】
一种鳞球茎茎线虫的LAMP快速检测方法


[0001]本专利技术属于植物病害的分子生物学检测领域，具体涉及一种鳞球茎茎线虫的LAMP快速检测方法。

技术介绍

[0002]鳞球茎茎线虫(Ditylenchus dipsaci)隶属于线虫动物门、垫刃目、粒科、茎线虫属，能引起多种植物毁灭性病害，是世界公认的危险性线虫，被列入我国检疫性有害生物名录。鳞球茎茎线虫的寄主范围极广，可寄生约40科500种植物，包括甘薯、马铃薯、燕麦、甜菜、洋葱、水仙、风信子、郁金香、唐菖蒲、朱顶红等。
[0003]研究表明，当每500g土壤中有10条线虫时就可严重危害洋葱、甜菜、胡萝卜等植物，严重侵染时损失可达60％～80％。在意大利，该线虫为害洋葱，种植之前苗期死亡率达60％；而法国和荷兰大蒜受侵染损失超过90％。
[0004]目前，鳞球茎茎线虫的鉴定以传统的形态学鉴定为主，必要时辅以分子生物学方法开展。但常规的特异引物PCR方法对设备要求高：需PCR仪、凝胶电泳仪等设备。环介导等温扩增(loop
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mediated isothermal amplification，LAMP)技术是近年来发展的一种新颖和较成熟的等温核酸扩增技术。与PCR方法相比，LAMP不需要PCR仪，扩增产物通过肉眼观察或浊度仪即可判定结果，适合于现场或条件较差的实验室进行快速检测。
[0005]因此，建立一种鳞球茎茎线虫的LAMP检测方法，以期能够快速、准确、灵敏、无污染的检测该线虫，是十分迫切和必要的。

技术实现思路
r/>[0006]针对现有技术存在的上述问题，本专利技术所要解决的第一技术问题在于提供一种鳞球茎茎线虫的LAMP快速检测方法；本专利技术所要解决的第二技术问题在于提供一种用于快速检测鳞球茎茎线虫的LAMP引物组；本专利技术所要解决的第三技术问题在于提供该LAMP引物组的应用。
[0007]为了解决上述技术问题，本专利技术所采用的技术方案如下：
[0008]本申请根据NCBI公布的鳞球茎茎线虫及其近似种序列进行了大量的研究、分析：包括线虫属内比较、属间比较，以及其它大量其它物种进行比较。设计了一种快速检测鳞球茎茎线虫的LAMP引物组，包括SEQ ID NO.1所示的正向外引物F3，SEQ ID NO.2所示的反向外引物B3，SEQ ID NO.3所示的正向内引物FIP，SEQ ID NO.4所示的反向内引物BIP，SEQ ID NO.5所示的正向内引物LF，SEQ ID NO.6所示的反向内引物LB。外引物F3/B3、内引物FIP/BIP能够针对鳞球茎茎线虫的基因上的6个区域进行识别扩增，分别位于3
′
端的F3c区段，F2c区段，F1c区段和5
′
端的B1区段，B2区段，B3区段。通过增加一对环引物LF/LB，促进LAMP反应，提升反应速率，缩短反应时间。
[0009]引物的核苷酸序列具体如下：
[0010]F3：CGGGATTGCTTTTTGGTGAGA；
[0011]B3：ATCACCAGTGAGCATCGTG；
[0012]FIP：TCGATAATGATCCGGCAGCAGGTTTGAACCGGGCAAAAGTCG；
[0013]BIP：ACACTAGGAATTGGACCTGGCTGCGGCACCCTCTTGGACTA；
[0014]LF：TCACCTACAGCCACCTTGT；
[0015]LB：GACCTTTTCCGTAGAATGAGGAAT。
[0016]上述快速检测鳞球茎茎线虫的LAMP引物组具有良好的物种特异性，即只有鳞球茎茎线虫样本呈阳性扩增，将其应用于鳞球茎茎线虫的LAMP快速检测中，一种鳞球茎茎线虫的LAMP快速检测方法，包括以下步骤：
[0017]1)以待测样品的DNA为模板，利用上述鳞球茎茎线虫的LAMP引物组进行LAMP扩增；
[0018]LAMP扩增的反应体系为：2.5μL待测样品的DNA模板、LAMP引物组中每条引物各1μL、反应酶1μL、RM反应液12.5μL，用去离子水补足体系，总反应体系体积为25μL；
[0019]LAMP扩增的反应条件为：63℃恒温反应45min；80℃灭活5min结束反应；
[0020]2)根据是否发生特异性的扩增判断待测样品中是否含有鳞球茎茎线虫；
[0021]若发生特异性的扩增，则表明待测样品中含有鳞球茎茎线虫；若未发生特异性的扩增，则表明待测样品中不含有鳞球茎茎线虫。
[0022]当在LAMP扩增的反应体系中加入荧光染料，能够实现鳞球茎茎线虫的LAMP可视化检测，具体包括以下步骤：
[0023]1)以待测样品的DNA为模板，利用鳞球茎茎线虫的LAMP引物组进行LAMP扩增；
[0024]LAMP扩增的反应体系为：2.5μL待测样品的DNA模板、LAMP引物组中每条引物各1μL、反应酶1μL、荧光染料1μL、RM反应液12.5μL，用去离子水补足体系，总反应体系体积为25μL；
[0025]LAMP扩增的反应条件为：63℃恒温反应45min；80℃灭活5min结束反应；
[0026]2)根据扩增产物的显色情况判断待测样品中是否含有鳞球茎茎线虫；
[0027]本申请在LAMP扩增的反应体系中加入了钙黄绿素；当扩增产物呈绿色，则表明待测样品中含有鳞球茎茎线虫；当扩增产物呈橙黄色，则表明待测样品中不含有鳞球茎茎线虫。
[0028]所述的LAMP引物组在快速检测植物组织样品中是否含有鳞球茎茎线虫中的应用。
[0029]所述的LAMP引物组在快速检测混合线虫样品中是否含有鳞球茎茎线虫中的应用。
[0030]其他植物线虫包括腐烂茎线虫、茎属线虫、粒属线虫、剪股颖粒线虫、维氏粒线虫、穿刺短体线虫、咖啡短体线虫、北方根结线虫、无花果孢囊线虫、松材线虫、菊花滑刃线虫、次薄滑刃线虫、柑橘半穿刺线虫、肾形肾状线虫、厚皮拟毛刺线虫、肾形拟毛刺线虫、长岭发垫刃线虫。
[0031]一种包括上述LAMP引物组的快速检测鳞球茎茎线虫的试剂盒，也在本专利技术的保护范围内。
[0032]相比于现有技术，本专利技术的有益效果为：
[0033]1)快速、便捷。本专利技术只需要45min即可完成LAMP反应，而且对仪器设备要求低，不需要PCR仪、凝胶成像系统等昂贵仪器，使用水浴锅即可完成检测。
[0034]2)特异性强。本专利技术只能够特异地扩增鳞球茎茎线虫，供试其它植物线虫均未发生扩增，具有物种特异性。
[0035]3)灵敏度较高。检测灵敏度为1/4000条线虫。
[0036]4)步骤简单。所有试剂在反应前添加，实现一步核酸扩增。
[0037]5)结果判定简便。其产物的检测方法比较多，用肉眼观察颜色或浊度就能够判断扩增与否，实现了结果可视化，还可采用实时浊度仪等方法判定。
[0038]6)对人和环境安全，检测过程不需要使用EB等有毒试剂。
附图说明
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种鳞球茎茎线虫的LAMP快速检测方法，其特征在于，包括以下步骤：1)以待测样品的DNA为模板，利用鳞球茎茎线虫的LAMP引物组进行LAMP扩增；2)根据是否发生特异性的扩增判断待测样品中是否含有鳞球茎茎线虫；所述鳞球茎茎线虫的LAMP引物组包括一对外引物F3/B3，一对内引物FIP/BIP和一对环引物LF/LB，引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1
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SEQ ID NO.6所示。2.根据权利要求1所述的鳞球茎茎线虫的LAMP快速检测方法，其特征在于，若发生特异性的扩增，则表明待测样品中含有鳞球茎茎线虫；若未发生特异性的扩增，则表明待测样品中不含有鳞球茎茎线虫。3.一种鳞球茎茎线虫的LAMP快速检测方法，其特征在于，包括以下步骤：1)以待测样品的DNA为模板，利用鳞球茎茎线虫的LAMP引物组进行LAMP扩增，LAMP扩增的反应体系中还包括有荧光染料；2)根据扩增产物的显色情况判断待测样品中是否含有鳞球茎茎线虫，实现鳞球茎茎线虫的LAMP可视化检测；所述鳞球茎茎线虫的LAMP引物组包括一对外引物F3/B3，一对内引物FIP/BIP和一对环引物LF/LB，引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1
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SEQ ID NO.6所示。4.根据权利要求3所述的鳞球茎茎线虫的LAMP快速检测方法，其特征在于...

【专利技术属性】
技术研发人员：俞禄珍，宋绍禕，李帅，于翠，王一椒，李丽，
申请(专利权)人：上海海关动植物与食品检验检疫技术中心，
类型：发明
国别省市：