无创方式判断子宫内膜容受性的方法、模型和标志物技术

无创方式判断子宫内膜容受性的方法、模型和标志物。本发明专利技术提供了以无创取样方式所获取的样本预测子宫内膜容受性的方法，以及使用所述样本建立预测模型的方法和所建立的预测模型，以及所述样本中与子宫内膜容受性相关联的标志物和相应的试剂盒。标志物和相应的试剂盒。标志物和相应的试剂盒。

【技术实现步骤摘要】
无创方式判断子宫内膜容受性的方法、模型和标志物
专利

[0001]本专利技术涉及生物领域和临床辅助生殖领域，更具体地涉及一种无创方式判断子宫内膜容受性的方法，和该方法中所用的标志物、预测模型和相应的试剂盒、系统。

技术介绍

[0002]人类生殖过程中，受精卵在母体子宫内定位、黏附、着床，最终发育成一个成熟的胎儿，着床过程对成功妊娠具有重要影响，成功的临床妊娠除需要优质的胚胎之外还需要良好的子宫内膜容受性(endometrial receptivity，ER)、子宫内膜与胚胎的同步发育。子宫内膜容受性是一种生理现象，是指子宫内膜对胚胎的接受能力，只有在短暂的特定时期内子宫内膜才允许胚胎着床，这一时期称为“着床窗口期”，就成年女性而言，相当于月经周期第20
‑
24日或排卵后6
‑
8日。
[0003]子宫内膜容受性的具体机制目前尚不完全清楚，但可以明确的是，子宫内膜处在非容受期是导致体外受精
‑
胚胎移植(IVF
‑
ET)中胚胎着床失败的重要原因之一。胚胎移植的成功率是非常重要的，直接关系到此前付出的所有代价和成本能够成功还是功亏一篑。然而，传统的利用月经周期窗口期的方式并不总是可行，甚至对于相当一部分受试者，例如反复移植失败的女性，或者罹患其他继发性不孕症的女性，着床窗口期的时间节点非常不准确，如果仍然按月经周期或者排卵日推算着床窗口期，会有很大移植失败的风险。
[0004]临床上已经有多种判断内膜容受性的方式，例如经阴道超声、血清雌孕激素水平、子宫内膜活检等方法来判断子宫内膜种植窗的时间，但均存在一定的误差。随着分子生物学的进步、尤其是人类基因组计划的完成，将基因作为分子标志物来辅助判断各种生理状态和病理状态的临床应用越来越成熟。但是，在子宫内膜容受性的预测上，已有的方法均存在一显著的缺点，即它们所用的样本均来自对内膜组织进行活检取样。这种有创的方式给母体带来了不必要的损伤，也有潜在的不稳定因素，因而降低了受试者的依从性，并且其损伤造成活检周期无法进行胚胎移植，延长了受试者的达孕时间与ART周期。此外，额外操作本身也是一种耗费资源、增加受试者痛苦的方式。
[0005]研究人员都一直在追求更简便的、创伤更小的检查方式，对于内膜容受性预测也不例外。临床上迫切需要一种高效的、无创的内膜容受性诊断方法。
[0006]专利技术简述
[0007]本专利技术提供了一种无创取样的判断子宫内膜容受性的方法。
[0008]在第一个方面，本专利技术提供了一种利用无创方式获取待分析活体样本的方法。在一个具体的实施方式中，所述无创方式是胚胎预移植时移植管壁粘附痕量组织。在另一个具体的实施方式中，所述无创方式是胚胎移植时移植管壁粘附痕量组织。
[0009]在一个实施方案中，通过无创方式所获取的样本中，细胞数少于1000个。在一个更具体的实施方案中，通过无创方式所获取的样本中，细胞数少于900个、800个、700个、600个、500个、400个、300个或200个。在一个优选的实施方案中，通过无创方式所获取的样本中，细胞数介于400个和300个之间。
[0010]在一个具体的实施方案中，本专利技术的方法进一步包括通过截取加冲洗的方法，将管壁的细胞、组织转移至样本采集管中。在一个具体的实施方案中，在一个优选的实施方案中，样本采集管内预先加入了组织样本保存液，
[0011]在一个实施方案中，本专利技术的方法进一步包括提取样本中的总RNA。在一个具体的实施方式中，所述提取过程采用亿康MALBAC白金微量RNA扩增试剂盒(KT110700724)，按照生产商提供的说明书进行。在另一个具体的实施方式中，所述提取过程包括以下步骤：a)对样本进行高速离心，(第一次1600g,2分钟；第二次3000g，3分钟；第三次13000rpm，5分钟)以沉淀全部细胞。b)去除上清液，加入200μL
×
2组织样本保存液重悬细胞，以3000g离心5分钟；200μL
×
1次，留约50μL。c)加入300μL细胞裂解液，剧烈震荡30秒至1分钟；瞬时离心，弃上清。d)加入350μL现配70％的乙醇后震荡混匀；瞬时离心，弃上清。e)加入650μL上述混合液体至吸附柱中，13000
×
g离心1分钟，弃离心废液。f)向吸附柱膜上加入500μL清洗缓冲液，13000
×
g离心1分钟，弃离心废液。g)将100μL DNA消化酶小心滴在吸附柱膜上，25度孵育15分钟。h)加入500μL清洗缓冲液，13000
×
g离心1分钟，弃离心废液；再次加入500μL的清洗缓冲液于吸附柱上，13000
×
g离心1分钟，弃离心废液。i)向管内加入700μL 80％乙醇13000
×
g离心2分钟，弃离心废液；再次13000
×
g离心1分钟，弃收集管。j)将吸附柱插入1.5mL离心管中，开盖晾干1分钟；加入20μL DEPC水，25度孵育1分钟，13000
×
g离心2分钟，再重复1次，共收集40μL洗脱液，即为总RNA。在一个更具体的实施方式中，无创取样所获得的微量样本中，几乎全部RNA都被抽提出来，从而为后续检测提供足量的纯化RNA核酸样品。
[0012]在一个实施方案中，本专利技术的方法进一步包括将RNA核酸样品中的mRNA逆转录，生成cDNA文库。在一个具体的实施方案中，所述逆转录使用亿康MALBAC白金微量RNA扩增试剂盒(KT110700724)，按照生产商提供的说明书进行。
[0013]在一个实施方案中，本专利技术的方法进一步包括进一步处理cDNA文库以构建测序文库。在一个具体的实施方案中，所述进一步处理使用使用亿康片段化试剂盒(KT100804248)和基因测序文库试剂盒(KT100804048)，按照生产商提供的说明书进行。
[0014]在一个实施方案中，本专利技术的方法进一步包括对所得文库实施测序。在一个具体的实施方式中，所述测序的方法是下一代测序(NGS,Next
‑
Generation Sequencing)。在另一个具体的实施方式中，所述测序的方法是Sanger法测序，或第三代测序(例如，诸如，纳米孔测序)。在本专利技术一个优选的实施例中，本专利技术使用Illumina Nextseq测序系统以及配套的Next
‑
seq High
‑
Output Kit试剂盒。
[0015]在第二个方面，本专利技术提供了一种容受性预测模型的建立方法。在一个实施方案中，本专利技术提供了一种对测序结果进行机器学习算法分析，并建立容受性预测模型的方法。
[0016]在一个具体的实施方案中，所述机器学习算法分析包括以下步骤：I)将样本按照金标准(实际临床结局)分为容受性和非容受性两类，并优选地拆分为两个集合，训练集和测试集，并取训练集样本数据进行下一步骤；II)将训练集样本全部数据去噪音、去偏倚，生成分别针对本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种获得用于预测受试者子宫内膜容受性的样本的方法，其特征在于，所述方法是无创方法，且所得样本中的细胞数优选地少于500个。2.权利要求1所述的方法，其中所述方法包括，从胚胎预移植时移植管壁粘附的痕量组织细胞中获取所述样本。3.权利要求1所述的方法，其中所述方法包括，从胚胎移植时移植管壁粘附的痕量组织细胞中获取所述样本。4.一种预测受试者子宫内膜容受性的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)通过权利要求1
‑
3任一项所述的方法获取样本；(2)在所述样本中检测子宫内膜容受性相关标志物的表达量。5.权利要求4所述的方法，其中子宫内膜容受性相关标志物是表2中的序号第1
‑
10的基因，即ELK4、PRKACB、PHB2、GM2A、PPA1、NCEH1、CAPG、DDIT4、LDHB和TDRD6，并且任选地还包括表2中序号第11
‑
250的一个或多个基因。6.一种生物标志物组合，其特征在于，包含表2中的序号第1
‑
10的基因，即ELK4、PRKACB、PHB2、GM2A、PPA1、NCEH1、CAPG、DDIT4、LDHB和TDRD6，并且任选地还包括表2中序号第11
‑
250的一个或多个基因。7.权利要求6所述的生物标志物组合在预测受试者子宫内膜容受性中的用途。8.权利要求6所述的生物标志物组合在制备用于预测受试者子宫内膜容受性的试剂盒中的用途。9.用于检测权利要求7或8所述的生物标志物组合的水平或其量的试剂在预测受试者子宫内膜容受性中的用途。10.用于检测权利要求7或8所述的生物标志物组合的水平或其量的试剂在制备用于预测受试者子宫内膜容受性的试剂盒中的用途。11.一种建立无创性容受性预测模型的方法，包括以下步骤：i.通过权利要求1

【专利技术属性】
技术研发人员：周岩，邹央云，滕晓明，李团，毛雅超，王羽，李昆明，陈淼鑫，
申请(专利权)人：苏州亿康医学检验有限公司，
类型：发明
国别省市：