一种多重取代扩增技术制备重复序列的封闭试剂的方法技术

本发明专利技术提供了一种多重取代扩增技术制备重复序列的封闭试剂的方法，该方法包括：采用多重取代扩增技术对基因组DNA进行扩增；对扩增产物进行纯化后，打断至200

【技术实现步骤摘要】
一种多重取代扩增技术制备重复序列的封闭试剂的方法


[0001]本专利技术是关于一种多重取代扩增技术制备重复序列的封闭试剂的方法，属于捕获建库


技术介绍

[0002]杂交捕获是NGS中目标区域捕获的主要技术之一，杂交过程中通常会采用两种封闭试剂来分别封闭adaptor序列和人类基因组上的重复序列。因为adaptor序列和人类基因组上的重复序列可能会和部分目标文库序列碱基互补结合，捕获磁珠捕获探针结合的目标区域文库的同时，这部分文库也结合在非目标文库上面，后续洗脱时候也洗脱不掉，从而使得非目标文库结合过多，导致捕获效率降低。所以不管是adaptor序列的封闭试剂，还是人类基因组上的重复序列的封闭试剂，任意一种封闭试剂使用错误的话都会显著降低捕获效率。
[0003]目前主流的液相捕获产品都会用到两种封闭试剂：通用封闭序列和Cot
‑
1 DNA；通用封闭序列的作用是封闭文库接头，减少接头杂交；Cot
‑
1 DNA的作用是封闭人基因组上的重复序列，减少重复序列杂交。
[0004]人基因组DNA的COT部分主要由快速退火的重复序列组成。SINE(小散在重复序列，例如Alu序列)和LINE(大散在重复序列，例如L1序列)等散在重复序列(IRS)在整个基因组中广泛分布。在富含这些重复序列的条件下，通过剪切、变性和再退火，由人胎盘DNA制备人COT DNA。
[0005]现有技术“人cot
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1DNA的制备”(革文新等，人cot
‑
>1DNA的制备[J]《肿瘤》，1998年5月，第18卷第3期(127))报道了采用羟基磷石灰柱层析法(HAP柱分离法)分离制备cot
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1DNA的方法。该方法是将获得的基因组DNA用超声波打断到需要大小，根据HAP的吸附能力和分离柱所装的HAP的量计算出所需要用的打断的DNA的量，100℃变性10min，冰浴骤冷，按照公式cot＝1＝mol/L
×
Ts计算DNA复性时间t，于60℃cot
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1DNA复性t秒，复性结束后，立即置于冰浴中10min，加入等体积的水溶液，将样品加入到HAP分离柱上，经过调整磷酸盐的浓度，依次洗脱游离核苷酸等杂质，单链核苷酸，最终洗脱cot
‑
1DNA洗脱峰，并收集，用两倍体积的乙醇室温沉淀收集的cot
‑
1DNA，8000r/min室温离心20min，用适当的水溶解所得到的盐和cot
‑
1DNA所得到的共沉淀混合物，然后用Sephadex G
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50脱盐，收集DNA峰，加入1/10体积3M的醋酸钠，和两倍体积的酒精8000r/min4℃离心20min，收集沉淀得到cot
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1DNA。上述制备cot
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1DNA的方法
‑
HAP柱分离法虽然制备效果可以满足杂交的需求，但是制作方法繁琐，且耗时耗力。目前，Invitrogen公司的商品cot
‑
1DNA是常见的商品化的cot
‑
1DNA，但是价格也是较为昂贵的。

技术实现思路

[0006]本专利技术的主要目的在于提供一种制备重复序列封闭试剂的新方法。
[0007]为实现上述目的，本专利技术提供了一种制备重复序列的封闭试剂的方法，该方法包
括：
[0008]采用多重取代扩增技术(MDA)对基因组DNA进行扩增；
[0009]对扩增产物进行纯化后，打断至约200
‑
300bp长度的DNA片段，所得产物即为重复序列的封闭试剂。
[0010]本专利技术中，采用多重取代扩增技术(MDA)对基因组DNA进行扩增以制备重复序列的封闭试剂。MDA是最近几年发展起来的一种单细胞全基因组扩增技术，该技术是基于环状滚动扩增方法创建的一种链置换扩增技术，MDA利用具有高度延伸活性的phi29DNA聚合酶和耐核酸外切酶的六聚体随机引物在等温条件下对基因组进行扩增。与DOP
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PCR和PEP
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PCR比较，MDA无论是扩增的效率还是扩增的可信度都明显具有优势，能均匀扩增全基因组，而没有明显的偏移。MDA可以从1
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10个拷贝的基因组DNA扩增出20
‑
30fg的产物。
[0011]利用本专利技术的方法制备重复序列的封闭试剂，可以规避现有技术方法存在的胎盘DNA不容易获得以及HAP柱分离法繁琐且费时费力的缺点。
[0012]根据本专利技术的具体实施方案，本专利技术的制备重复序列的封闭试剂的方法，还包括提取基因组DNA的过程。
[0013]根据本专利技术的具体实施方案，本专利技术的制备重复序列的封闭试剂的方法中，基因组DNA的提取可以使用本领域的现有技术，包括使用商品化的基因组提取试剂盒。
[0014]在本专利技术的一些具体实施方案中，按照以下方法提取基因组DNA：
[0015]提取基因组DNA的时候加入核裂解液、蛋白酶K、SDS以使组织能够充分裂解，37℃
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56℃消化12
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16小时；3000
‑
10000rpm离心5
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15min将DNA分离。
[0016]根据本专利技术的具体实施方案，本专利技术的制备重复序列的封闭试剂的方法中，采用多重取代扩增技术对基因组DNA进行扩增过程中，采用以下引物：
[0017]中度重复序列和/或高度重复序列的引物；或
[0018]将Cot
‑
1 DNA打断后作为随机引物。
[0019]根据本专利技术的具体实施方案，本专利技术的制备重复序列的封闭试剂的方法中，所述中度重复序列和/或高度重复序列的引物可选自Alu、Kpn、LINE中的一种或多种。优选地，所述中度重复序列和/或高度重复序列的引物包括Alu、Kpn、LINE家族中的各至少一种，即，至少包括Alu家族中的至少一种、Kpn家族中的至少一种以及LINE家族中的至少一种(对)。
[0020]根据本专利技术的具体实施方案，本专利技术的制备重复序列的封闭试剂的方法中，将Cot
‑
1 DNA打断后作为随机引物时，是将Cot
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1 DNA打断至约20
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40bp小片段。
[0021]根据本专利技术的具体实施方案，本专利技术的制备重复序列的封闭试剂的方法中，采用多重取代扩增技术对基因组DNA进行扩增过程按照以下操作进行：
[0022]对样本进行裂解，中和后离心，加入扩增混合液，进行PCR扩增。优选地，扩增时，其中PCR仪中设置30℃，8h；65℃，5min；热盖70℃。
[0023]根据本专利技术的具体实施方案，本专利技术的制备重复序列的封闭试剂的方法中，裂解采用的裂解液配方包括：每1反应体积，裂解缓冲液1.15μl，DTT 0.35μl，NF水1.5μl。
[0024]根据本专利技术的具体实施本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种制备重复序列的封闭试剂的方法，该方法包括：采用多重取代扩增技术对基因组DNA进行扩增；对扩增产物进行纯化后，打断至200
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300bp长度的DNA片段，所得产物即为重复序列的封闭试剂。2.根据权利要求1所述的方法，该方法还包括提取基因组DNA的过程。3.根据权利要求2所述的方法，其中，按照以下方法提取基因组DNA：提取基因组DNA的时候加入核裂解液、蛋白酶K、SDS以使组织能够充分裂解，37℃
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56℃消化12
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16小时；3000
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10000rpm离心5
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15min将DNA分离。4.根据权利要求1所述的方法，其中，采用多重取代扩增技术对基因组DNA进行扩增过程中，采用以下引物：中度重复序列和/或高度重复序列的引物；或将Cot
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1 DNA打断后作为随机引物。5.根据权利要求4所述的方法，其中，所述中度重复序列和/或高度重复序列的引物包括Alu、Kpn、LINE家族中的一种或多...

【专利技术属性】
技术研发人员：王兴兴，万成，任军，
申请(专利权)人：苏州亿康医学检验有限公司，
类型：发明
国别省市：