一种脂肪间充质干细胞分泌因子的制备方法技术

本发明专利技术公开了一种脂肪间充质干细胞分泌因子的制备方法，涉及间充质干细胞分泌因子提取技术领域，该制备方法包括以下步骤：步骤一，细胞复苏；步骤二，传代培养：使用传代培养基对脂肪间充质干细胞进行传代培养；步骤三，分泌因子收获；上述步骤二中的传代培养基包括干细胞基础培养基400

【技术实现步骤摘要】
一种脂肪间充质干细胞分泌因子的制备方法


[0001]本申请涉及间充质干细胞分泌因子提取领域，更具体地说，它涉及一种脂肪间充质干细胞分泌因子的制备方法。

技术介绍

[0002]间充质干细胞(mesenchymalstemcell，MSC)是属于中胚层的一类多能干细胞，具有强大的增殖能力和多向分化潜能，在适宜的体内或体外环境下不仅可分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞，还具有分化为肌细胞、肝细胞、造血细胞、神经细胞、胰岛细胞等多种细胞的能力，MS细胞可以在适合的环境中分化成特定细胞来修复损伤组织，而旁分泌作用在治疗组织损伤中发挥了更大的作用，即MSC分泌细胞因子在组织修复中起了很大的作用。
[0003]相关技术中，在间充质干细胞分泌因子的提取过程中，选取细胞活力较强的第三代间充质干细胞作为分泌因子来源，于培养瓶中培养第三代间充质干细胞；待细胞融合度达到80％以上时，吸去培养上清液，使用PBS液清洗两次，更换为无血清培养基；培养48小时后收集上清液，用0.22μm的滤膜过滤，将上清液倒入90mm无菌培养皿中，放入冻干箱内预冻；当温度降至
...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种脂肪间充质干细胞分泌因子的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤一，细胞复苏：对脂肪间充质干细胞进行细胞复苏；步骤二，传代培养：使用传代培养基对脂肪间充质干细胞进行传代培养；步骤三，分泌因子收获：移除传代培养基，收集上清液，得到脂肪间充质干细胞分泌因子；上述步骤二中的传代培养基包含以下重量份的原料：干细胞基础培养基400
‑
600ml/L、L
‑
丙氨酰
‑
L
‑
谷氨酰胺1
‑
3mmol/L、4
‑2‑
羟乙基
‑1‑
哌嗪乙磺酸10
‑
20μmol/L、胰岛素2.0
‑
6.0μg/mL 、D
‑
葡萄糖10
‑
20g/L、L
‑
抗坏血酸10
‑
100μmol/L、30
‑
50μg/mL全反式维甲酸、血清蛋白0.3
‑
0.8μg/mL、类胰蛋白酶0.1
‑
0.3μg/mL、人参皂苷10.0
‑
20.0μg/mL。2.根据权利要求1所述的脂肪间充质干细胞分泌因子的制备方法，其特征在于：所述传代培养基包括干细胞基础培养基460ml/L、L
‑
丙氨酰
‑
L
‑
谷氨酰胺2.2mmol/L、4
‑2‑
羟乙基
‑1‑
哌嗪乙磺酸15μmol/L、胰岛素3.5μg/mL 、D
‑
葡萄糖14g/L、L
‑
抗坏血酸56μmol/L、35μg/mL全反式维甲酸、血清蛋白0.6μg/mL、类胰蛋白酶0.2μg/mL、人参皂苷16μg/mL。3.根据权利要求1所述的脂肪间充质干细胞分泌因子的制备方法，其特征在于：所述传代培养基中还加入有1
‑
2g/L的混合助剂，所述混合助剂由诱导增强剂和分泌增强剂按质量比为1:（0.2
‑
0.6）组成。4.根据权利要求3所述的脂肪间充质干细胞分泌因子的制备方法，其特征在于：所述诱导增强剂选用亚硒酸钠、三磷酸腺苷和二甲基甲酰胺中的任意一种或任意多种按任意比的组合物。5.根据权利要求3所述的脂肪间充质干细胞分泌因子的制备方法，其特征在于：所述分泌增强剂选用亚麻酸、羟基磷脂和脂肪醇聚氧乙烯醚中的任意一种或任意多种按任意比的组合物。6.根据权利要求1所述的脂肪间充质干细胞分泌因子的制备方法，其特征在于：所述混合助剂由诱导增强剂和分泌增强剂按质量比为1:0.4组成。7.根据权利要求1所述的脂肪间充质干细胞分泌因子的制备方法，其特征在于：所述干细胞基础培养基选用BME培养基、DMEM培养基和MEM培养基中的任意一种。8.根据权利要求1所述的脂肪间充质干细胞分泌因子的制备方法，其特征在于：所述步骤一具体包括如下操作：A1：向离心管中倒入基础培养基8
‑
10mL，预热到35
‑
40℃，静置待用；A2：将从液氮罐中提取的带有冻存管的脂肪间充质干细胞放入35
‑
40℃水浴锅中，旋盖朝上直立放置，水面不得没过冻存管管盖，摇动冻存管，使冻存液快速融化；A3：冻存管中的脂肪间充质干细胞融化后，旋开管盖，用移液管吸取脂肪间充质干细胞到操作A1中装有基础培养基的离心管内，并用移液管向转空的冻存管中加入0.8
‑
1mL基础培养基，轻轻震荡冲洗管壁，将冲洗液倒入对应的离心管中，拧紧管盖，颠倒混匀，放入离心机，300g离心5
‑
10min；A4：用移液管吸弃上清液，旋紧管盖，震散细胞沉淀，旋开管盖，向离心管中加入基础培养基，定容至9
‑
10mL，旋紧管盖，颠倒混匀，放入离心机，300g离心5
‑
10min；A5：用移液管吸弃上清液，旋紧管盖，震散细胞沉淀，旋开管盖，向离心管中加入溶液C，溶液C的加入量为4
‑
5mL/支，旋紧管盖，颠倒混匀，得到细胞悬液；
A6:用移液管吸取溶液C，按照28
‑
30mL／瓶量加入到T
‑
175培养瓶中，用移液管吸取操作A5中得到的细胞悬液，接种至T
‑
175培养瓶中，细胞接种量为1.0
×
106‑
1.2
×
106／T
‑
175，拧紧瓶盖，晃动均匀，标记编码，标记操作日期将培养瓶放入培养箱中培养68
‑
72h。9.根据权利要求1所述的脂肪间充质干细胞分泌因子的制备方法，其特征在于：所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵进军，杨桂花，赵宇飞，
申请(专利权)人：和携科技有限公司，
类型：发明
国别省市：