脐带干细胞冻干粉在制备药物及化妆品中的应用制造技术

本发明专利技术涉及脐带干细胞冻干粉在制备药物及化妆品中的应用。本发明专利技术从侧金盏花中分离鉴定制备得到了具有较好抗冻活性的蛋白，将所述蛋白用于干细胞的冻干粉制备中能够保护干细胞的活性以及提高抗氧化活性，制备的冻干粉可以有效的用于皮肤损伤修复的药物制备以及皮肤抗氧化的化妆品的制备，具有较好的效果以及应用价值。应用价值。

【技术实现步骤摘要】
脐带干细胞冻干粉在制备药物及化妆品中的应用


[0001]本专利技术涉及生物领域，更具体的涉及脐带干细胞冻干粉在化妆品及药品中的 应用。

技术介绍

[0002]脐带间充质干细胞(Mesenchymal Stem Cells，MSCs)是指存在于新生儿脐 带组织中的一种多功能干细胞，它能分化成许多种组织细胞，具有广阔的临床应 用前景。
[0003]脐带间充质干细胞(MSCs)具有较高的分化潜能，可向多个方向进行分化。 它在骨、软骨、肌肉、肌腱、韧带、神经、肝、内皮和心肌等组织工程方面具有 广阔的临床应用前景。有报道从人脐带中分离出MSCs，且细胞含量、增殖能力 优于骨髓MSCs，免疫原性比骨髓MSCs低，并且具有取材方便，无伦理学争议等 优点，因此越来越受到研究工作者们的关注。干细胞的培养体系主要应用含动物 血清(如胎牛血清)的培养基，在此种环境下生长的干细胞，其内部结构会发生 何种变化尚未可知，为避免含动物血清培养中病毒等病原体污染和异种血清所致 的过敏反应，课题组进行了以人脐带血血清为主体的培养体系体外培养扩增脐带 间充质干细胞的实验研究。以探讨人脐带血血清替代动物血清用于培养临床组织 工程用干细胞的可行性。同时研究脐带间充质干细胞形态学、生长特性、细胞周 期、免疫表型等特性，旨在建立脐带间充质干细胞的富集方法，为建立脐带间充 质干细胞库和临床应用提供有力的理论依据。
[0004]正是基于脐带间充质干细胞的重要性，目前针对脐带间充质干细胞的保存变 得尤为重要。CN110839614B公开了一种自体脐带间充质干细胞冻存液及其制备 和冻存方法，冻存液由配合使用的A液和B液组成，A液与B液的体积比为6
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9: 1
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3；所述A液按照体积份数计，包括如下成分：65
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75份含预添加物的基础培 养基；预添加物与基础培养基的比为7
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12mg：0.6
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0.9mL；其中，预添加物按重 量份数计，包括：4
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6份巴戟天醇提取物、0.13
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0.16份Ⅰ型胶原、0.05
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0.15 份透明质酸钠和3
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5份硫辛酸；所述B液按照体积份数计，包括如下成分：15
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25 份自体血清。使用本专利技术的冻存液能够在新生儿分娩时同步获得足量的血液用于 分离自体血清，从而有效避免异种异体来源的血清蛋白污染，同时模拟细胞外基 质微环境，提高细胞复苏存活率，从而有利于其在生物样本库标准化操作和临床 细胞治疗中的应用。
[0005]CN111011363B提供了一种间充质干细胞冻存液，包括以下工作浓度的组分： 间充质干细胞培养上清液25～35mL/100mL，甘油4～6mL/100mL，聚乙烯吡咯烷 酮4～6g/100mL，聚乙烯醇0.5～1.5g/100mL，海藻糖0.5～2.5g/100mL，羟基 磷灰石纳米颗粒1～2.5g/100mL，全反式维甲酸0.5～1.5mg/100mL，血清替代物 8～12mL/100mL；所述间充质干细胞培养上清液通过以下方法制备得到：78～82 ％汇合度下的间充质干细胞培养22～26h，过滤，保留滤液，即得间充质干细胞 培养上清液。本专利技术的冻存液能有效减少细胞在冻存和复苏过程中受到的损伤， 提高复苏后细胞活性。
[0006]但是目前的脐带间充质干细胞冻干方法制备的到的冻干粉的组分太复杂，效 果
还有待进一步的提高。CN112876545A提供了一种新的具有较高抗冻活性的抗 冻蛋白，该蛋白具有抑制冰晶生长与重结晶功能，在结构保护和细胞保护等方面 具有应用潜力，为低温保护剂开发提供候选。现有研究也表明，部分抗冻蛋白也 兼具有抗氧化的活性，因此，针对脐带间充质干细胞开发一种特异性的抗冻抗氧 化蛋白用于冻干粉的制备变得尤为重要。

技术实现思路

[0007]本专利技术特异性的筛选制备获得了一种抗冻特性较好的抗冻蛋白，该抗冻蛋白 用于脐带间充质干细胞冻干粉的制备具有较好的效果。
[0008]一方面，本专利技术提供一种抗冻蛋白的序列如SEQ ID NO：1所示。
[0009]本专利技术提供了一种抗冻蛋白，由如SEQ ID No.1所示的氨基酸序列组成的 蛋白质，或在SEQ ID No.1所示的氨基酸序列中经取代、缺失或插入一个或多 个氨基酸所获得的具有同等活性的蛋白质。
[0010]具体地，可通过现有的体外表达体系对所述抗冻蛋白进行生产制备，例如大 肠杆菌表达系统。
[0011]另外一方面，本专利技术提供脐带间充质干细胞冻干粉的制备方法，所述方法包 括：间充质干细胞加入无血清、无抗生素的DMEM/F12培养基至细胞浓度在 108/ml，用等渗PBS溶液离心(1000r/min，离心5min)、洗涤3遍。将脐带间充 质干细胞分装1mL到1.5mL的离心管中，保证每个样品中有足够量的细胞，离心 1600r/min，离心4min，去掉上清液，将30％抗冻蛋白(w/v)保护剂加入到细胞 中，以10℃/min从室温降到
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80℃，平衡10min，在冻干温度
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20
‑‑
35℃，真空 度为50～200Pa，冻干24
‑
36小时，得到的冻干粉即为脐带干细胞冻干粉。
[0012]进一步的，本专利技术提供一种抗冻蛋白在制备用于脐带间充质干细胞冻干粉中 的用途。
[0013]进一步的，本专利技术提供一种脐带间充质干细胞冻干粉在制备用于皮肤修复和 皮肤抗氧化的药物组合物中的用途。
[0014]进一步的，本专利技术提供一种脐带间充质干细胞冻干粉在制备用于皮肤修复和 皮肤抗氧化的化妆品中的用途。
[0015]进一步的，所述冻干冻干介质除了抗冻蛋白之外，还可以包括甘露醇，二糖 或明胶，其中二糖选自蔗糖，海藻糖和蔗糖与海藻糖的混合物。在一个实施方 案中，冻干介质包含约1％甘露醇，约1％二糖或约0.25％明胶，其中二糖选自蔗 糖，海藻糖和蔗糖与海藻糖的混合物。在一个实施方案中。在一个实施方案中， 抗冻蛋白是溶解在磷酸盐缓冲液中，其中磷酸盐缓冲液具有约10mM的浓度。在 一个实施方案中，磷酸盐缓冲液是浓度为约10mM和pH为约7.2的磷酸钾缓冲液。 在一个实施方案中，冻干介质包含在pH7.2的10mM磷酸钾缓冲液中的抗冻蛋白 以及甘露醇，蔗糖和明胶。
[0016]本专利技术的组合物可以通过任何合适的方式给药，例如口服，例如以丸剂，片 剂，胶囊，颗粒剂或散剂的形式给药；舌下；颊部；胃肠外，例如通过皮下 注射，皮内注射，鼻内注射，静脉内注射，肌肉内注射，腹膜内注射或胸骨内注 射或使用输注技术(例如，作为无菌可注射的水溶液或非水溶液或悬浮液)；鼻 部，例如通过吸入喷雾，气雾剂，喷雾或喷雾器；局部使用，如乳膏剂，软膏 剂，膏剂，散剂或凝胶；透皮的，如贴剂形式的；透粘膜；或直肠给
Tris
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HCl(pH＝7.4),0.1mol/L KCl,0.本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种抗冻蛋白在制备用于脐带间充质干细胞冻干粉中的用途；其中抗冻蛋白的序列如SEQ ID NO：1所示；所述脐带间充质干细胞冻干粉的制备方法为脐带间充质干细胞加入无血清、无抗生素的DMEM/F12培养基至细胞浓度在108/ml，用等渗PBS溶液离心1000r/min，离心5min、洗涤3遍；将脐带间充质干细胞分装1mL到1.5mL的离心管中，离心1600r/min，离心4min，去掉上清液，将30％抗冻蛋白w/v保护剂加入到细胞中，以10℃/min从室温降到
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80℃，平衡10min，在冻干温度
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【专利技术属性】
技术研发人员：吕荣取，张然，
申请(专利权)人：北京岳淘生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：