一种微生物检测的双适配体功能核酸恒温微流控芯片传感器制造技术

本发明专利技术公开了一种微生物检测的双适配体功能核酸恒温微流控芯片传感器。将样品液、磁性捕获复合体

【技术实现步骤摘要】
一种微生物检测的双适配体功能核酸恒温微流控芯片传感器


[0001]本专利技术属于生物检测
，本专利技术涉及一种微生物检测的双适配体功能核酸恒温微流控芯片传感器。

技术介绍

[0002]蜡样芽孢杆菌是一种可以产生中生芽孢的革兰氏阳性菌。常在蔬菜、乳制品以及肉制品等富含蛋白质的食物中被检出，可以产生肠毒素、呕吐毒素等毒素，从而引发食物中毒事件。蜡样芽孢杆菌的内生芽孢在经过适当的热处理后会萌发，同时热处理又可以消灭其他微生物，在无竞争的情况下芽孢萌发，蜡样芽孢杆菌可以更好地繁殖。蜡样芽孢杆菌的芽孢具有疏水性，可以黏附上皮细胞，易引起人体肠道感染，也可引起局部组织和全身性感染。因此针对蜡样芽胞杆菌的快检方法亟待开发与应用。
[0003]目前，检测蜡样芽胞杆菌的主要方法有较为传统的平板培养法、分子生物学法、免疫法以及物化法等。平板培养法耗时长，操作起来较麻烦；分子生物学法对人员操作和仪器设备的要求较高，无法实现恒温检测；免疫法中不仅抗体价格昂贵而且亲和力较低，稳定性和结合能力还易受到pH值或温度变化的影响；拉曼/表面增强拉曼散射法、红外光谱法、分光光度法、质谱分析等也可实现直接检测，数据准确、检测限低，但是检测成本较高、设备庞大，并不适合现场检测。
[0004]核酸适配体是一类单链寡核苷酸，可形成高级结构与靶标物质结合，具有较强的亲和力和结合特异性。相比于抗体，核酸适配体在检测和治疗工作中更具优势，通过筛选、优化获得的核酸适配体作为一种小型的生物传感元件，可以在致病菌的检测中发挥巨大作用：与靶菌结合后，可产生构象变化，变化可引发扩增、发光等一系列反应，通过核酸适配体的变化或其引起的其他物化生变化来反映靶菌数量。在不同检测设备下，最初的靶菌数量信息可以通过核酸适配体的变化形成光电信号，从输出设备中传递出相应信号。
[0005]微流控芯片指的是通过微米级流道、腔室搭建起来的微反应实验室，借助液相与流道之间的表面张力、阻力等物理因素控制流体流动、混合反应的一类芯片装置。微流控芯片可与PCR等技术联用用于致病菌的检测。目前，微流控芯片已被用于国家标准微生物高通量检测工作中。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的是一种微生物检测的双适配体功能核酸恒温微流控芯片传感器。为蜡样芽孢杆菌的基于核酸适配体的检测工作提供研究依据，解决检测中存在的抗体、基因组依赖性高，耗时长，操作繁琐，特异性低，灵敏度低、无法现场检测等问题。
[0007]一方面，本专利技术提供一种蜡样芽孢杆菌检测的双适配体功能核酸恒温微流控芯片传感器，其特征在于，由暗箱、微流控芯片及控制装置组成。
[0008]所述暗箱是由箱体、暗箱顶盖、紫外灯珠隔板及紫外灯珠组成，其中暗箱顶盖上留有采集窗。
[0009]所述微流控芯片包括识别元件、转化元件以及信号输出元件。
[0010]所述识别元件是指连接有蜡样芽孢杆菌适配体的磁性捕获复合体，其中蜡样芽孢杆菌适配体通过全细胞筛选、裁剪获得；既可以识别菌体又可以实现电磁分离，其中适配体序列如SEQ ID NO：1所示。
[0011]所述转化元件是通过探针将蜡样芽孢杆菌信号转化为核酸信号；所述信号转化元件是哑铃型探针和滚环扩增引物组成，其中哑铃型探针作为扩增模板，滚环扩增引物作为扩增引物，其中哑铃型探针序列如SEQ ID NO：3所示，滚环扩增引物序列如SEQ ID NO：5所示。
[0012]所述信号输出元件即通过智能手机拍摄微流控芯片的反应腔，并根据获得的RGB值和标准曲线推知靶菌浓度；所述微流控芯片是由上样板、流道板及底部玻璃板组成；所述微流控芯片的上样板上包括用于上样待测液体的样品的上样口、用于上样适配体功能化磁珠的上样口、用于上样RCA
‑
发光体系的上样口、用于上样1
×
BB缓冲液的上样口及用于放置海绵的废液出样口；在上样时，可一次性将待测样品、磁性捕获复合体
‑
哑铃型探针、缓冲液以及RCA
‑
发光体系沿对应上样口加入对应腔内；所述微流控芯片的流道板上包括用于储存各进样试剂的待测样品进样腔、磁珠进样腔、RCA
‑
发光体系进样腔、1
×
BB缓冲液进样腔、反应腔用于放置海绵的废液腔及连接各腔体结构的微流道；所述控制装置是控制微流控芯片内液体流动的装置，实现一次性上样检测。
[0013]所述控制装置包括顶盖、四个定位螺母、四个螺杆、四个触点、电磁铁、芯片底座、卡扣及芯片更换滑块组成；所述顶盖上留有用于固定定位螺母及电磁铁的安装孔以及用于方便进样的与下方微流控芯片对应的进样孔。
[0014]另一方面，本专利技术提出的微流控芯片生物传感器识别元件是通过全细胞筛选和裁剪获得的蜡样芽孢杆菌适配体。
[0015]所述全细胞筛选的具体过程为：(a) 取1
‑
2 nmol随机文库，90
‑
95℃变性 5
‑
10 min，立即至于冰上，放置5
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10 min，在已处理的文库中加入500
‑
600 μL菌悬液，以及过量的 tRNA 和BSA。30
‑
37℃ 100
‑
120 rpm 振荡培养45
‑ꢀ
90min。
[0016](b) 孵育后6000
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8000 rpm，4℃离心5
‑
10 min，与目标菌体相结合的 ssDNA 随着菌体被沉降下来，而未与目标菌体结合的ssDNA 则在上清中，尽量倒掉上清，用 1
×
BB 清洗2
‑
3遍沉淀，去除结合能力较弱的ssDNA。
[0017](c) 加入80
‑
100μL 1
×
TE缓冲液重悬结合 ssDNA 文库的菌体，90
‑
95℃加热5
‑
10 min，立即置于冰上5
‑
10 min，使得结合在菌体表面的适配体因变性从菌体表面脱离。
[0018](d) 将悬液置于冷冻离心机中 4℃，10000
‑
12000rpm，离心5
‑
10min，吸取上清液保存，记为M，并以此为模板进行大量PCR扩增，为下一轮筛选用的文库做准备。具体加入量如表3所示。PCR反应条件为：95
‑
98℃预变性4min，95
‑
98℃变性10s，55
‑
60℃退火20s，72℃延伸20 s，72℃再延伸2 min，反应循环数设置范围10
‑
18。
[0019](e) 收集各管的 PCR 产物，使用 PCR 产物纯化试剂盒清除无关试剂，取纯化后
样品，加入 0.1倍体积的 Lambda核酸外切酶缓冲液和 Lambda外切酶混合均匀（如50 μL 反应体系，加入 5μL Lambda核酸外切酶），于 35
‑
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种蜡样芽孢杆菌检测的双适配体功能核酸恒温微流控芯片传感器，其特征在于，由暗箱、微流控芯片及控制装置组成；所述暗箱是由箱体、暗箱顶盖、紫外灯珠隔板及紫外灯珠组成；所述微流控芯片包括识别元件、转化元件以及信号输出元件；所述识别元件是指连接有蜡样芽孢杆菌适配体的磁性捕获复合体，其中蜡样芽孢杆菌适配体通过全细胞筛选、裁剪获得；所述转化元件是通过探针将蜡样芽孢杆菌信号转化为核酸信号；所述信号输出元件即通过智能手机拍摄微流控芯片的反应腔，并根据获得的RGB值和标准曲线推知靶菌浓度；所述控制装置是控制微流控芯片内液体流动的装置，实现一次性上样检测。2.如权利要求1所述的微流控芯片生物传感器，其特征在于，所述微流控芯片是由上样板、流道板及底部玻璃板组成；所述微流控芯片的上样板上包括用于上样待测液体的样品的上样口、用于上样适配体功能化磁珠的上样口、用于上样RCA
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发光体系的上样口、用于上样1
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BB缓冲液的上样口及用于放置海绵的废液出样口；在上样时，可一次性将待测样品、磁性捕获复合体
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哑铃型探针、缓冲液以及RCA
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发光体系沿对应上样口加入对应腔内；所述微流控芯片的流道板上包括用于储存各进样试剂的待测样品进样腔、磁珠进样腔、RCA
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发光体系进样腔、1
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BB缓冲液进样腔、反应腔用于放置海绵的废液腔及连接各腔体结构的微流道。3.如权利要求1所述的微流控芯片生物传感器，其特征在于，所述控制装置包括顶盖、四个定位螺母、四个螺杆、四个触点、电磁铁、芯片底座、卡扣及芯片更换滑块组成；所述顶盖上留有用于固定定位螺母及电磁铁的安装孔以及用于方便进样的与下方微流控芯片对应的进样孔。4.如权利要求1所述的微流控芯片生物传感器，其特征在于，所述识别元件是连接有蜡样芽孢杆菌适配体的磁性捕获复合体，既可以识别菌体又可以实现电...

【专利技术属性】
技术研发人员：许文涛，周子琦，朱龙佼，张文强，杜再慧，
申请(专利权)人：中国农业大学，
类型：发明
国别省市：