一株野生型屎肠球菌ZK03及其电击转化方法和应用技术

一株野生型屎肠球菌ZK03及其电击转化方法和应用，属于微生物领域。该菌株已于2022年1月5日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏号为：GDMCCNo:62192。该菌株不含肠球菌毒力因子Asa1、cylA、efaA、esp、gelE和hyl。该菌株具有良好的耐酸、耐猪胆盐、耐高温和耐生理盐水特性，且在室温生理盐水中可长期存活；该菌株对金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、大肠杆菌具有一定抑制作用，可用于制备抑菌剂，同时还可作为饲料添加剂发酵生产饲料。本发明专利技术的一株野生型屎肠球菌ZK03的电击转化方法，操作简单，转化效率高，重复性强。重复性强。重复性强。

【技术实现步骤摘要】
一株野生型屎肠球菌ZK03及其电击转化方法和应用


[0001]本专利技术属于微生物
，具体涉及一株野生型屎肠球菌(Enterococcus faecium)ZK03及其电击转化方法和应用。

技术介绍

[0002]屎肠球菌(Enterococcus Faecium，E.faecium)是人和动物肠道正常菌群之一，属于革兰氏阳性球菌，无荚膜和鞭毛，具有良好的耐酸、耐高温和耐胆盐的性质。根据大量文献报道，屎肠球菌能够产生乳酸、细菌素、过氧化氢等物质，对大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄菌等有一定的抑制作用。在食品中，屎肠球菌发酵有助于产生香气和风味，延长货架期，改善微生物环境。在畜牧养殖中，屎肠球菌常被用来作为替康产品之一，具有良好的应用前景。由于屎肠球菌具有较厚的细胞壁结构以及毒力基因的存在，限制了其发展和应用。
[0003]电转化法是革兰氏阳性细菌最常用的引入外源DNA分子的方法之一。但是目前关于专门适用于屎肠球菌电转化的方法不是很多，因此，通常参考乳酸乳球菌电转化的方法进行屎肠球菌的电转化，由于屎肠球菌的异质性比较大，电转化条件不均一，因此乳酸乳球菌电转化方法应用在屎肠球菌上时存在转化效率较低的问题，提高了转化难度，且现有电转化方法操作繁琐，甚至难以获得阳性转化子。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的是提供一株野生型屎肠球菌(Enterococcus faecium)ZK03及其电击转化方法和应用。
[0005]本专利技术为解决技术问题所采用的技术方案如下：
[0006]本专利技术的一株野生型屎肠球菌(Enterococcus faecium)ZK03，该菌株已于2022年1月5日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏号为：GDMCC No:62192。
[0007]作为优选的实施方式，该菌株不含有肠球菌毒力因子Asa1、cylA、efaA、esp、gelE和hyl。
[0008]本专利技术的一株野生型屎肠球菌(Enterococcus faecium)ZK03的电击转化方法，包括以下步骤：
[0009]步骤一、野生型屎肠球菌(Enterococcus faecium)ZK03感受态细胞的制备将活化的野生型屎肠球菌(Enterococcus faecium)ZK03接种于含1～3％(M/V)甘氨酸的改良培养基中，培养至平台期或平台后期，收集菌液，冰浴、离心收集菌体，用含30％(M/V)PEG1000的电击缓冲液进行洗涤、重悬，置于
‑
80℃保存；
[0010]步骤二、电击转化
[0011]按体积比为3:1的比例取野生型屎肠球菌(Enterococcus faecium)ZK03感受态细胞和穿梭质粒PAMB401，冰浴后混匀，加入预冷的电转杯中静置后，电击1次，电压为1400～2450V，电击时间为4～5ms；加入复苏培养基，取培养物涂布于筛选培养基中，完成电击转化过程。
ZK03 efaA；4：E.faecium ZK03 esp；5：E.faecium ZK03 gelE；6：E.faecium ZK03 hyl；7：ATCC29212 Asa1；8：ATCC29212 cylA；9：ATCC29212 efaA；10：ATCC29212 esp；11：ATCC29212 gelE；12：ATCC29212 hyl。
[0025]图3为实施例5中不同电击缓冲液对野生型屎肠球菌(E.faecium ZK03转化效率的影响。缓冲液Ⅰ：蔗糖、甘油；缓冲液Ⅱ：CaCl2、PEG
30
‑
100
；缓冲液Ⅲ：MgCl2、PEG
30
‑
100
；缓冲液Ⅳ：10％甘油；缓冲液
Ⅴ
：PEG
30
‑
100
；缓冲液
Ⅵ
：PEG
30
‑
70
。
[0026]图4为实施例4中野生型屎肠球菌(Enterococcus faecium)ZK03的抑菌试验结果。图中，A为空白对照，B为沙门氏菌，C为大肠杆菌，D为金黄色葡萄球菌，E为金黄色葡萄球菌培养24h后观察抑菌情况，F为沙门氏菌培养24h后观察抑菌情况，G为大肠杆菌培养24h后观察抑菌情况。
[0027]图5为实施例9中野生型屎肠球菌(Enterococcus faecium)ZK03电转化后的质粒琼脂糖凝胶电泳结果。M：Maker
2000
，泳道1：空载体PAMB401。
具体实施方式
[0028]下面将结合本专利技术实施例，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。
[0029]实施例1野生型屎肠球菌(Enterococcus faecium)ZK03的分离鉴定
[0030]一、筛选
[0031](1)收集健康猪的粪便，适当稀释后涂布于肠球菌筛选性培养基中，纯化培养，分离出纯菌落，于
‑
80℃保藏。
[0032](2)通过抑菌试验或其他试验，筛选出多株菌株，选取其中效果最好的菌株ZK03。
[0033]二、鉴定
[0034]采用常规生化鉴定方法进行生化鉴定。鉴定方法具体包括培养特征鉴定、形态特征鉴定、分子鉴定，具体如下：
[0035](1)培养特征鉴定：
[0036]菌落在BHI培养基中培养，直径在0.5～1mm，菌落表面光滑，边缘整齐，白色或乳白色不透明，接种环挑取略有粘稠感。
[0037](2)形态特征鉴定：
[0038]用ZEISS sigma300场发射扫描电子显微镜观察，菌丝呈圆形或椭圆形，无芽孢，革兰氏染色呈阳性。采用常规革兰氏染色，菌落形态呈现单个、成对或者链状，无芽孢和荚膜。
[0039](3)分子鉴定：
[0040]将所筛选的菌株ZK03培养数天后，用细菌基因组提取试剂盒提取总DNA，测定其浓度及纯度，用屎肠球菌特异性引物(F：TTGAGGCAGACCAGATTGACG，R：TATGACAGCGACTCCGATTCC)进行种、属水平鉴定，PCR扩增反应体系为50μL：DNA模板2μL、上游引物2.5μL、下游引物2.5μL、2
×
Premix Taq DNA聚合酶25μL、ddH2O 18μL。PCR扩增程序为：94℃5min，94℃30s、52℃30s、72℃40s、30
×
，72℃7min；然后用16SrRNA通用引物(27F：AGAGTTTGATCCTGGCTCAG，1492R：ACGGCTACCTTGTTACGACTT)扩增基因组DNA，PCR扩增反应体
系为50μL：DNA模板2μL、上游引物2.5μL、下游引物2.5μL、2...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一株野生型屎肠球菌(Enterococcus faecium)ZK03，其特征在于，该菌株已于2022年1月5日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏号为：GDMCC No:62192。2.根据权利要求1所述的一株野生型屎肠球菌(Enterococcus faecium)ZK03，其特征在于，该菌株不含有肠球菌毒力因子Asa1、cylA、efaA、esp、gelE和hyl。3.如权利要求1所述的一株野生型屎肠球菌(Enterococcus faecium)ZK03的电击转化方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤一、野生型屎肠球菌(Enterococcus faecium)ZK03感受态细胞的制备将活化的野生型屎肠球菌(Enterococcus faecium)ZK03接种于含1～3％(M/V)甘氨酸的改良培养基中，培养至平台期或平台后期，收集菌液，冰浴、离心收集菌体，用含30％(M/V)PEG1000的电击缓冲液进行洗涤、重悬，置于
‑
80℃保存；步骤二、电击转化按体积比为3:1的比例取野生型屎肠球菌(Enterococcus faecium)ZK03感受态细胞和穿梭质粒PAMB401，冰浴后混匀，加入预冷的电转杯中静置后，电击1次，电压为1400～2450V，电击时间为4～5ms；加入复苏培养基，取培养物涂布于筛选培养基中，完成电击转化过程。4.根据权利要求3所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：王玮，谢改杰，金鑫鑫，张雪，黄燕华，曲庆，
申请(专利权)人：仲恺农业工程学院，
类型：发明
国别省市：