一种基于雪花状碳氮复合材料及核酸外切酶III的荧光适体传感器检测黄曲霉毒素B1制造技术

本发明专利技术涉及了基于雪花状碳氮复合材料及核酸外切酶III的荧光适配体传感器检测黄曲霉毒素B1，包括以下步骤：通过恒温振荡的方法，将黄曲霉毒素B1适配体A1与互补链C1结合，然后加入黄曲霉毒素B1，黄曲霉毒素B1与适配体结合，部分互补链被释放使得互补链和标记有荧光染料的DNA链D1结合。此时，加入核酸外切酶III，并加入雪花状碳氮复合材料，由于互补链C1与DNA链D1形成的DNA双链中带负电荷的磷酸骨架内碱基的有效屏蔽，使得此双链DNA不能吸附在雪花状碳氮复合材料上，从而造成响应信号的变化，实现对目标物的定量检测。根据响应信号的变化，得到了基于雪花状碳氮复合材料及核酸外切酶III的荧光适配体传感器检测黄曲霉毒素B1。同其它用于黄曲霉毒素B1检测的荧光传感器相比，所制备的荧光适配体传感器具有灵敏度高、重复性好、准确度高的优点。准确度高的优点。准确度高的优点。

【技术实现步骤摘要】
一种基于雪花状碳氮复合材料及核酸外切酶III的荧光适体传感器检测黄曲霉毒素B1


[0001]本专利技术涉及一种基于雪花状碳氮复合材料及核酸外切酶III的荧光适体传感器检测黄曲霉毒素B1，尤其涉及一种DNA双链的制备方法。

技术介绍

[0002]黄曲霉毒素B1（AFB1）是由真菌产生的毒性最强的真菌毒素之一，主要存在于受污染或发霉的作物和发酵产品中，如玉米、花生、谷物、酱油和黄酒。同时，AFB1还具有致畸、致突变和致癌的作用，对人和动物的健康有严重的威胁。因此，建立一种快速、准确的检测和控制食品中AFB1的方法对食品安全和人类健康都至关重要。
[0003]目前，AFB1分析方法依赖于高效液相色谱
‑
荧光法（HPLC
‑
FL）。尽管具有高灵敏度和准确性，但该技术需要专业操作员和昂贵的设备。免疫方法如酶联免疫吸附法（ELISA）也已经开发出来，并已投入可用的商业测试试剂盒，主要用于常规分析。即使此方法操作简便，但稳定性较差。而且，抗体在制备、稳定性和成本方面也存在一些限制。
[0004]与抗体相比，核酸适体（aptamer）具有独特的特性，例如易于化学合成和官能团修饰，良好的稳定性以及价格便宜等。适体已用于生物传感器和多种靶标的多功能分析。近年来，基于表面增强拉曼散射（SERS）、电化学和荧光等，开发了用于检测AFB1的适体传感器。在这些传感器中，荧光传感器由于操作简单，灵敏度高等优点在化学领域得到了广泛的应用。
[0005]综上所述，基于核酸适体的荧光传感器方法具有相对显著的优势，特异性强、操作简单、稳定性好，具有相当好的应用前景。

技术实现思路

[0006]一种基于雪花状碳氮复合材料及核酸外切酶III的荧光适体传感器检测黄曲霉毒素B1一种基于雪花状碳氮复合材料及核酸外切酶III的荧光适体传感器检测黄曲霉毒素B1，其特征在于，包括以下步骤：所述的DNA双链的形成：吸取等体积的黄曲霉毒素B1的适体A1与互补链C1于100~200 μL离心管中，通过恒温振荡的方式以碱基互补配对的方式结合。
[0007]所述的荧光适体传感器首先是形成AFB1的适体链A1与互补链C1的DNA双链。当样本中含有AFB1时，适体链A1与AFB1结合，部分互补链被释放，使得互补链C1和标记有荧光染料的DNA链D1结合。此时，加入核酸外切酶III，并加入雪花状碳氮复合材料，由于互补链C1与DNA链D1形成的DNA双链（dsDNA）中带负电荷的磷酸骨架内碱基的有效屏蔽，使得dsDNA不能吸附在雪花状碳氮复合材料上，从而造成响应信号的变化。由此，得到了一种基于雪花状碳氮复合材料及核酸外切酶III检测黄曲霉毒素B1的荧光适体传感器。
[0008]所述的互补链C1的序列为C1
‑
1：5
’‑
TGTGGGCCTAGCGACTCCACAATA
‑3’
或C1
‑
2：5
’‑
TGTGGGCCTAGGACTCCACAATA
‑3’
或C1
‑
3：5
’‑
TGTGGGCCTAGCACTCCACAATA
‑3’
。
[0009]所述的DNA链D1的3
’
端荧光基团分别为Cy3，Cy5，FAM，ROX，Alexa Fluor 488，Alexa Fluor 594中的一种。
[0010]所述的DNA链D1的序列为D1
‑
1：5
’‑
CTAGGCCCACA
‑3’
或D1
‑
2：5
’‑
GGAGTCGCTAG
‑3’
或D1
‑
3：5
’‑ꢀ
TATTGTGGAGT
ꢀ‑3’
。
[0011]所述的雪花状碳氮复合材料为雪花状碳氮钯、雪花状碳氮铁、雪花状碳氮硫中的一种。
[0012]所述的AFB1的适体A1的序列为5
’‑
GTTGGGCACGTGTTGTCTCTCTGTGTCTCGTGCCCTTCGCTAGGCCCACA
‑3’
。
[0013]所述的恒温振荡温度为20~50℃，时间为1~2 h。
[0014]所述的AFB1的适体A1及其互补链C1的总体积范围在10 μL～20 μL，浓度范围在1 μmol/L~5 μmol/L。
[0015]所述的缓冲液为Tris
‑
HCl，PBS，HEPES中的一种或两种，体积范围在0.5 μL～10 μL，pH范围在6.0～8.0。
[0016]所述的AFB1的孵育时间为0.5 h~1.5 h。
[0017]所述的核酸外切酶III的用量为1~5 U，孵育时间为0.5 h~2.5 h。
[0018]所述的雪花状碳氮复合材料的浓度为1~5 mg/mL。
[0019]上述说明仅是本专利技术技术方案的概述，为了能够更清楚了解本专利技术的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本专利技术的较佳实施例并配合附图详细说明如后。
附图说明
[0020]图1为基于雪花状碳氮复合材料及核酸外切酶III的荧光适体传感器检测黄曲霉毒素B1传感器制备示意图。
具体实施方式
[0021]下面结合附图和实施例，对本专利技术的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本专利技术，但不用来限制本专利技术的范围。
[0022]实施例1具体步骤如下：（1）双链DNA的形成：准确吸取1 μmol/L黄曲霉毒素B1的适体A1与互补链C1
‑
1各10 μL于200 μL离心管中，涡旋充分混匀，置于37℃恒温振荡仪中振荡1 h。
[0023]（2）加入10 μL不同浓度的黄曲霉毒素B1置于37℃恒温振荡仪中振荡0.5 h。待充分振荡后，加入5 U核酸外切酶III，10 μL 2 mg/mL的雪花状碳氮钯复合材料和10 μL 1 μmol/L DNA链D1
‑
2：5
’‑
GGAGTCGCTAG
‑
FAM
‑3’
，再置于37℃恒温振荡仪中振荡1 h。孵育完成后，用pH=8.0的Tris
‑
HCl缓冲液补充溶液体积至200 μL。设置激发波长为490 nm，发射波长测量范围510~600 nm，在荧光分光光度计下记录520 nm发射波长时的荧光强度。
[0024]（3）为评价该传感器在食品基质中应用的可行性，经过前处理制备玉米粉的加标样品处理液，通过最优条件下制备的传感器检测处理液中AFB1含量，计算加标回收率。取5.0 g玉米粉末并加入不同浓度的AFB1，然后与25 mL的萃取溶剂(甲醇：水，7：3(v/v)) 混
合。然后，将样品充分震荡30 min，之后以5000 r/min的速度离心10 min，用0.45 μ本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于雪花状碳氮复合材料及核酸外切酶III的荧光适体传感器检测黄曲霉毒素B1，其特征在于，包括以下步骤：（1）DNA双链的形成：吸取等体积的黄曲霉毒素B1（AFB1）的适体A1与互补链C1于100~200 μL离心管中，通过恒温振荡的方式将两条链以碱基互补配对的方式结合；（2）荧光适体传感器的构建首先是形成AFB1的适体链A1与互补链C1的DNA双链；当样本中含有AFB1时，适体链A1与AFB1结合，部分互补链被释放，使得互补链C1和标记有荧光染料的DNA链D1结合；此时，加入核酸外切酶III，并加入雪花状碳氮复合材料，由于互补链C1与DNA链D1形成的DNA双链（dsDNA）中带负电荷的磷酸骨架内碱基的有效屏蔽，使得dsDNA不能吸附在雪花状碳氮复合材料上，从而造成响应信号的变化；由此，得到了一种基于雪花状碳氮复合材料及核酸外切酶III的荧光适体传感器检测黄曲霉毒素B1。2.根据权利要求1所述的一种基于雪花状碳氮复合材料及核酸外切酶III的荧光适体传感器检测黄曲霉毒素B1，其特征在于，步骤（1）中，所述的互补链C1的序列为C1
‑
1：5
’‑
TGTGGGCCTAGCGACTCCACAATA
‑3’
或C1
‑
2：5
’‑
TGTGGGCCTAGGACTCCACAATA
‑3’
或C1
‑
3：5
’‑
TGTGGGCCTAGCACTCCACAATA
‑3’
。3.根据权利要求1所述的一种基于雪花状碳氮复合材料及核酸外切酶III的荧光适体传感器检测黄曲霉毒素B1，其特征在于，步骤（2）中，所述的DNA链D1的3
’
端荧光基团分别为Cy3，Cy5，FAM，ROX，Alexa Fluor...

【专利技术属性】
技术研发人员：卫敏，赵路阳，索志光，白天，金华丽，何保山，
申请(专利权)人：河南工业大学，
类型：发明
国别省市：