【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于分子检测的光触发核酸构建体和方法
交叉引用
[0001]本申请要求于2019年5月20日提交的美国临时专利申请号62/850,239的优先权，其通过引用以其全文并入本文用于所有目的。
技术介绍
[0002]核酸(NA)检测是用于检测、定量和识别脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)分子特定序列的遗传结构的独特分析技术。NA检测具有很多应用，并且广泛用于生命科学研究和分子诊断。与应用和测试场所无关，检测样品中的遗传物质(RNA或DNA拷贝)量通常非常小而无法直接检出；因此，使用物理化学方法、生物化学方法或酶方法来增强生成的靶标特异性信号以确保更灵敏的检测是非常普遍的。其中一些方法利用分子扩增过程如聚合酶链反应(PCR)以增加靶NA的拷贝数。这些检测被分类并广为人知，通常被归类为核酸扩增检测(NAAT)。此外，扩增方法包括，例如：链置换扩增(SDA)，和基于核酸序列的扩增(NASBA)以及滚环扩增(RCA)。
[0003]NAAT方法具有多种不同的性能标准，包括分析灵敏度、特异性、检测限(LoD)、定量范围、检测动态范围(DDR)和周转时间(TAT)。不同的应用需要不同的标准，并且根据所使用的方法，总是存在折衷。例如，在感染性疾病应用中，准确识别临床标本中是否存在感染病原体至关重要。因此，人们需要NAAT方法，该方法每次检测可提供一些生物体的LOD，而定量范围则不那么重要，因为患者治疗不太依赖该信息。另一方面，在基因表达应用中，临床样品中信使RNA(mRNA)的浓度相对较大，DDR比LOD重要得多。
[00...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种反应室，包括：a)包含光敏化学部分的核酸构建体，其中所述核酸构建体处于第一分子状态，其中所述核酸构建体被配置为在暴露于光后改变为第二分子状态；b)至少一种试剂；和c)至少一种酶；其中所述反应室被配置为允许所述光到达所述核酸构建体。2.如权利要求1所述的反应室，其中所述核酸构建体是寡核苷酸引物或探针。3.如权利要求1
‑
2中任一项所述的反应室，其中所述至少一种酶是聚合酶、逆转录酶、末端转移酶、核酸外切酶、核酸内切酶、限制酶或连接酶。4.如权利要求1
‑
3中任一项所述的反应室，其中所述至少一种试剂包括一种或多种扩增试剂。5.如权利要求1
‑
4中任一项所述的反应室，还包括靶核酸。6.如权利要求5所述的反应室，其中所述酶被配置为催化与所述靶核酸、所述至少一种试剂和所述核酸构建体相关的反应。7.如权利要求6所述的反应室，其中处于所述第一分子状态的所述核酸构建体被配置为在所述反应中是有活性的。8.如权利要求7所述的反应室，其中处于所述第二分子状态的所述核酸构建体被配置为在所述反应中是无活性的。9.如权利要求6所述的反应室，其中处于所述第一分子状态的所述核酸构建体被配置为在所述反应中是无活性的。10.如权利要求9所述的反应室，其中处于所述第二分子状态的所述核酸构建体被配置为在所述反应中是有活性的。11.如权利要求1
‑
10中任一项所述的反应室，还包括包含另一光敏化学部分的另一核酸构建体，其中所述另一核酸构建体处于第三分子状态，其中所述另一核酸构建体被配置为在暴露于另一光后改变为第四分子状态。12.如权利要求11所述的反应室，其中所述另一光是所述光。13.如权利要求11或权利要求12所述的反应室，其中处于所述第一分子状态的所述核酸构建体被配置为在所述反应中是有活性的，并且处于所述第三分子状态的所述另一核酸构建体被配置为在所述反应中是无活性的。14.如权利要求11
‑
13所述的反应室，其中处于所述第二分子状态的所述核酸构建体被配置为在所述反应中是无活性的，并且处于所述第四分子状态的所述另一核酸构建体被配置为在所述反应中是有活性的。15.如权利要求11或权利要求12所述的反应室，其中处于所述第一分子状态的所述核酸构建体和处于所述第三分子状态的所述另一核酸构建体被配置为在所述反应中是有活性的。16.如权利要求11、12和15中任一项所述的反应室，其中处于所述第二分子状态的所述核酸构建体和处于所述第四分子状态的所述另一核酸构建体被配置为在所述反应中是无活性的。17.如权利要求11或权利要求12所述的反应室，其中处于所述第一分子状态的所述核
酸构建体和处于所述第三分子状态的所述另一核酸构建体被配置为在所述反应中是无活性的。18.如权利要求11、12和17中任一项所述的反应室，其中处于所述第二分子状态的所述核酸构建体和处于所述第四分子状态的所述另一核酸构建体被配置为在所述反应中是有活性的。19.如权利要求6
‑
18中任一项所述的反应室，其中所述酶是所述聚合酶，所述反应是聚合酶链反应，并且所述核酸构建体是所述寡核苷酸引物。20.如权利要求1
‑
19中任一项所述的反应室，其中所述光敏化学部分位于所述核酸构建体的3
‑
末端、5
‑
末端或中间。21.如权利要求1
‑
20中任一项所述的反应室，其中所述核酸构建体还包含另外的光敏化学部分。22.如权利要求1
‑
21中任一项所述的反应室，其中所述第五分子状态是所述第一分子状态，并且所述第六分子状态是所述第二分子状态。23.如权利要求1
‑
22中任一项所述的反应室，其中所述反应室是闭管反应室。24.一种进行反应的方法，包括：激活反应室以进行反应，所述反应室包括：a)包含处于第一分子状态的光敏化学部分的核酸构建体；b)至少一种试剂；和c)至少一种酶；以及激活光以到达所述反应室中的所述核酸构建体，从而将所述核酸构建体改变为第二分子状态。25.如权利要求24所述的方法，其中所述核酸构建体是寡核苷酸引物或探针。26.如权利要求24或权利要求25所述的方法，其中所述至少一种酶是聚合酶、逆转录酶、末端转移酶、核酸外切酶、核酸内切酶、限制酶或连接酶。27.如权利要求24
‑
26中任一项所述的方法，其中所述至少一种试剂包括一种或多种扩增试剂。28.如权利要求24
‑
27中任一项所述的方法，其中所述反应室还包括靶核酸。29.如权利要求28所述的方法，其中所述酶催化所述靶核酸与所述至少一种试剂和所述核酸构建体的所述反应。30.如权利要求24
‑
29中任一项所述的方法，其中处于所述第一分子状态的所述核酸构建体在所述反应中是有活性的。31.如权利要求24
‑
30中任一项所述的方法，其中处于所述第二分子状态的所述核酸构建体被配置为在所述反应中是无活性的。32.如权利要求24
‑
29中任一项所述的方法，其中处于所述第一分子状态的所述核酸构建体在所述反应中是无活性的。33.如权利要求24
‑
29和32中任一项所述的方法，其中处于所述第二分子状态的所述核酸构建体在所述反应中是有活性的。34.如权利要求24所述的方法，其中所述反应室还包括处于第三分子状态的包含另一光敏化学部分的另一核酸构建体，其中所述另一核酸构建体被配置为在暴露于另一光后改
变为第四分子状态。35.如权利要求34所述的方法，其中所述另一光是所述光，并且其中所述激活所述光激活所述核酸构建体。36.如权利要求34或权利要求35所述的方法，还包括：激活所述另一光以到达所述另一核酸构建体。37.如权利要求34
‑
36中任一项所述的方法，还包括：在所述激活所述光之后，在所述反应中使所述核酸构建体失活。38.如权利要求34所述的方法，还包括：在所述激活所述光之后或在所述激活所述另一光之后激活所述另一核酸构建体。39.如权利要求34所述的方法，还包括：在所述激活所述光或所述激活所述另一光之后使所述另一核酸构建体失活。40.如权利要求34
‑
36所述的方法，还包括：在所述激活所述光之后，在所述反应中激活所述核酸构建体。41.如权利要求30所述的方法，还包括：在所述激活所述光或所述激活所述另一光之后使所述另一核酸构建体失活。42.如权利要求41所述的方法，还包括：在所述激活所述光或所述激活所述另一光之后激活所述另一核酸构建体。43.如权利要求34
‑
42中任一项所述的方法，其中所述反应是延伸、消化、转录、末端转移或连接。44.如权利要求34
‑
43中任一项所述的方法，其中当在所述反应室中进行所述反应时，不向所述反应室中加入外部试剂。45.如权利要求34
‑
44中任一项所述的方法，其中当在所述反应室中进行所述反应时，均未从所述反应室中去除所述核酸构建体、所述至少一种试剂或所述至少一种酶。46.如权利要求24
‑
45中任一项所述方法，其中所述酶是所述聚合酶，所述反应是聚合酶链反应，并且所述核酸构建体是所述寡核苷酸引物。47.如权利要求24
‑
46中任一项所述的方法，其中所述光敏化学部分位于所述核酸构建体的3
‑
末端、5
‑
末端或中间。48.如权利要求24
‑
47中任一项所述的方法。其中所述核酸构建体还包含另外的光敏化学部分。49.如权利要求28
‑
48中任一项所述的方法，其中所述靶核酸包含主等位基因和次等位基因，并且其中所述反应是聚合酶链反应。50.如权利要求49所述的方法，其中所述核酸构建体包含与所述主等位基因互补的序列。51.如权利要求50所述的方法，其中处于所述第一分子状态的所述核酸构建体在关于产生所述主等位基因的扩增子的所述聚合酶链反应中是无活性的。52.如权利要求51所述的方法，其种处于所述第二分子状态的所述核酸构建体在关于产生所述主等位基因的所述扩增子的所述聚合酶链反应中是有活性的。53.如权利要求51所述的方法，其中处于所述第二分子状态的所述核酸构建体在关于产生所述主等位基因的所述扩增子的所述聚合酶链反应中是无活性的。
54.如权利要求49
‑
53中任一项所述的方法，其中所述另一核酸构建体是所述次等位基因的引物，并且所述方法还包括在所述激活所述光之前产生所述次等位基因的扩增子。55.一种核酸构建体，包括：a)多个核苷酸；和b)一个或多个可光裂解部分；其中所述一个或多个可光裂解部分中的每一个独立地位于：a)所述核酸构建体的3
’‑
末端；b)所述核酸构建体的5
’‑
末端；c)所述3
’‑
末端和所述5
’‑
末端之间；d)核碱基上或与核碱基相连；e)核糖上或与核糖相连；f)所述多个核苷酸的两个连续成员之间并与所述多个核苷酸的该两个连续成员相连；或g)其组合。56.如权利要求55所述的核酸构建体，其中所述核酸构建体被配置为在生化反应中是无活性的，其中所述生化反应是聚合酶催化的链延伸、聚合酶链反应(PCR)、逆转录聚合酶链反应(RT
‑
PCR)、连接、末端转移酶延伸、杂交、核酸外切酶消化、核酸内切酶消化或限制酶消化。57.如权利要求55或权利要求56所述的核酸构建体，其中所述核酸构建体被配置为在所述一个或多个可光裂解部分光裂解后形成核酸分子，并且其中所述核酸分子被配置为在所述生化反应中是有活性的。58.如权利要求55
‑
57中任一项所述的核酸构建体，其中所述核酸构建体是引物，并且其中所述生化反应是聚合酶催化的链延伸。59.如权利要求58所述的核酸构建体，其中所述一个或多个可光裂解部分位于所述3
’‑
末端。60.如权利要求58所述的核酸构建体，其中所述一个或多个可光裂解部分中的每一个独立地位于所述3
’‑
末端和所述5
’‑
末端之间并位于选定的核碱基上。61.如权利要求58所述的核酸构建体，其中所述一个或多个可光裂解部分中的每一个独立地位于所述3
’‑
末端和所述5
’‑
末端之间并位于所述多个核苷酸的两个连续成员之间。62.如权利要求61所述的核酸构建体，其中所述3
’‑
末端被配置为在所述生化反应中是无活性的。63.如权利要求61所述的核酸构建体，其中所述核酸构建体包含第一核酸部分和与所述第一核酸部分互补的第二核酸部分，其中所述核酸构建体被配置为形成发夹结构。64.如权利要求63所述的核酸构建体，其中所述第一核酸部分和所述第二核酸部分不包含所述一个或多个可光裂解部分。65.使用权利要求55
‑
64中任一项的所述核酸构建体进行所述聚合酶催化的链延伸的方法，包括：a)提供包含所述核酸构建体、至少一种模板核酸分子、聚合酶的反应混合物，其中所述核酸构建体具有与所述模板核酸分子互补的序列；
b)使所述反应混合物经受用于所述聚合酶催化的链延伸的条件；和c)用光的光子辐射所述反应混合物或所述核酸构建体，从而进行所述聚合酶催化的链延伸。66.如权利要求65所述的方法，其中b)中的所述经受不能实现c)中的所述进行。67.如权利要求65或权利要求66所述的方法，其中在c)中的所述辐射之前，所述核酸构建体在所述反应混合物中保持完整。68.如权利要求65
‑
67中任一项所述的方法，还包括：在c)中，切割所述一个或多个可光裂解部分。69.如权利要求65
‑
68中任一项所述的方法，还包括：在c)中，形成所述核酸分子。70.如权利要求65
‑
69中任一项所述的方法，其中在c)中的所述进行包括使用所述辐射后在c)形成的所述核酸分子作为用于所述聚合酶催化的链延伸的引物。71.如权利要求65
‑
70中任一项所述的方法，其中所述反应混合物还包含另一引物，其中所述另一引物在所述聚合酶催化的链延伸中是有活性的。72.如权利要求71所述的方法，其中在c)中的所述辐射之前，所述另一引物在所述聚合酶催化的链延伸中是有活性的。73.如权利要求71或权利要求72所述的方法，其中b)中的所述聚合酶催化的链延伸产生包含所述另一引物的扩增子。74.如权利要求65
‑
73中任一项所述的方法，其中所述聚合酶催化的链延伸是定量聚合酶链反应(Q
‑
PCR)，所述方法还包括：在c)中1)在存在权利要求55
‑
64中任一项所述的核酸构建体的情况下，对两个或多个核苷酸序列进行所述聚合酶催化的链延伸以在流体中产生两个或多个扩增子；2)提供一阵列，所述阵列包含在可独立定位的位置具有多种核酸探针的固体表面，所述阵列被配置为接触所述流体；和3)在所述流体与所述阵列接触时，测量所述两个或多个扩增子与所述多种核酸探针的两种或多种核酸探针的杂交以获得扩增子杂交测量，其中所述扩增子包含猝灭剂。75.如权利要求65
‑
73中任一项所述的方法，其中所述聚合酶催化的链延伸是定量聚合酶链反应(Q
‑
PCR)，所述方法还包括：在c)中1)提供包含具有表面和多种不同探针的固体载体的阵列，所述多种不同探针在不同可定位的位置固定于所述表面，每个可定位的位置包含荧光部分；2)对包含多个核苷酸序列的样品进行PCR扩增；所述PCR扩增在流体中进行，其中：(i)权利要求55
‑
64中任一项的所述核酸构建体是每个核酸序列的PCR引物并且包含猝灭剂；和(ii)所述流体与所述多种不同探针接触，其中所述PCR扩增中产生的扩增子与所述多种探针杂交，从而猝灭来自所述荧光部分的信号；3)随时间检测在每个所述可定位的位置处来自所述荧光部分的所述信号；4)使用随时间检测的所述信号并确定所述流体中的所述扩增子的量；和5)使用所述流体中所述扩增子的量来确定所述样品中所述核苷酸序列的量。76.如权利要求65
‑
73中任一项所述的方法，其中所述聚合酶催化的链延伸是定量聚合酶链反应(Q
‑
PCR)，所述方法还包括：在c)中：1)提供包含含有至少一种模板核酸分子的核酸样品、引物对和聚合酶的所述反应混合
物，其中所述引物对与所述模板核酸分子具有序列互补性，并且其中所述引物对包含限制引物和过量引物，其中所述限制引物和所述过量引物中的至少一种是权利要求55
‑
64中任一项的所述核酸构建体；2)在足以产生作为所述模板核酸分子和所述限制引物的扩增产物的至少一种靶核酸分子的条件下，使所述反应混合物进行所述Q
‑
PCR，其中所述至少一种靶核酸分子包含所述限制引物；3)使所述反应混合物与传感器阵列接触，所述传感器阵列具有(i)基底，所述基底包含固定于所述基底的表面的不同单独可定位的位置的多种探针，其中所述探针与所述限制引物具有序列互补性并且能够捕获所述限制引物，和(ii)检测器阵列，所述检测器阵列被配置为检测来自所述可定位的位置的至少一个信号，其中所述至少一个信号指示所述限制引物与所述多种探针中的单个探针结合；4)在所述核酸扩增反应过程中的多个时间点，使用所述检测器阵列检测来自一个或多个所述可定位的位置的所述至少一个信号；和5)基于指示所述限制引物与所述多种探针中的所述单个探针结合的所述至少一个信号，检测所述靶核酸分子。77.一种使用权利要求55
‑
64中任一项的所述核酸构建体测定至少一种靶核酸分子的系统，包括：1)包含反应混合物的反应室，所述反应混合物包含含有至少一种模板核酸分子的核酸样品、具有与所述模板核酸分子互补的序列的引物对和聚合酶，其中所述引物对包含限制引物和过量引物，其中所述限制引物和所述过量引物中的至少一种是权利要求55
‑
64中任一项的所述核酸构建体，其中包含所述反应混合物的所述反应室被配置为促进对所述反应混合物的核酸扩增反应以产生作为所述模板核酸的扩增产物的至少一种靶核酸分子；2)传感器阵列，所述传感器阵列包含(i)基底，所述基底包含固定于所述基底的表面不同单独可定位的位置的多种探针，其中所述探针与所述限制引物具有序列互补性并且能够捕获所述限制引物；和(ii)检测器阵列，所述检测器阵列被配置为检测来自所述可定位的位置的至少一个信号，其中所述至少一个信号指示所述限制引物与所述多种探针中的单个探针结合；以及3)计算机处理器，所述计算机处理器与所述传感器阵列耦合并被编程为(i)使所述反应混合物进行所述核酸扩增反应，和(ii)在所述核酸扩增反应过程中的多个时间点检测来自一个或多个所述可定位的位置的所述至少一个信号。78.一种核酸构建体，包括：a)多个核苷酸；和b)一个或多个可光裂解部分；其中所述一个或多个可光裂解部分中的每一个独立地位于：a)所述核酸构建体的3
’‑
末端和所述核酸构建体的5
’‑
末端之间；b)核碱基上或与核碱基相连；c)核糖上或与核糖相连；d)所述多个核苷酸的两个连续成员之间并与所述多个核苷酸的该两个连续成员相连；或
e)其组合。79.如权利要求78所述的核酸构建体，其中所述核酸构建体被配置为在生化反应中是有活性的，其中所述生化反应是聚合酶催化的链延伸、聚合酶链反应(PCR)、逆转录聚合酶链反应(RT
‑
PCR)、连接、末端转移酶延伸、杂交、核酸外切酶消化、核酸内切酶消化或限制酶消化。80.如权利要求78和权利要求79所述的核酸构建体，其中所述核酸构建体被配置为在所述一个或多个可光裂解部分光裂解后形成核酸分子，并且其中所述核酸分子被配置为在所述生化反应中是无活性的。81.如权利要求78和权利要求79所述的核酸构建体，其中所述核酸构建体被配置为在所述一个或多个可光裂解部分光裂解后不久形成核酸分子，并且其中所述核酸分子在所述生化反应中是有活性的，其中所述核酸分子位于所述3
’‑
末端附近。82.如权利要求78
‑
81中任一项所述的核酸构建体，其中所述核酸构建体是引物，并且其中所述生化反应是聚合酶催化的链延伸。83.如权利要求82所述的核酸构建体，其中所述一个或多个可光裂解部分中的每一个独立地位于所述3
’‑
末端和所述5
’‑
末端之间并位于选定的核碱基上。84.如权利要求83所述的核酸构建体，其中所述核酸构建体被配置为在所述一个或多个可光裂解部分不存在的情况下形成发夹结构，从而在所述一种或多种可光裂解部分不存在的情况下作为所述引物失去活性。85.如权利要求82所述的核酸构建体，其中所述一个或多个可光裂解部分中的每一个独立地位于所述3
’‑
末端和所述5
’‑
末端之间并位于所述多个核苷酸的两个连续成员之间。86.如权利要求82
‑
85中任一项所述的核酸构建体，其中所述核酸构建体包含与模板核酸分子互补的第一序列，并且其中所述第一序列位于3
’‑
末端或其附近。87.如权利要求86所述的核酸构建体，其中所述核酸构建体还包含与所述模板核酸分子互补的第二序列，其中所述第二序列位于5
’‑
末端或其附近，并且其中所述一个或多个可光裂解部分中的至少一个位于所述第一序列和所述第二个序列之间。88.如权利要求87所述的核酸构建体，其中所述一个或多个可光裂解部分通过至少一个核苷酸与所述第一序列和/或所述第二序列分离。89.如权利要求87或权利要求88所述的核酸构建体，其中所述核酸构建体被配置为当所述第一序列和所述第二序列与所述模板核酸分子杂交时，在所述第一序列和所述第二序列之间形成发夹环。90.如权利要求87
‑
89中任一项所述的核酸构建体，其中所述第二序列包括与所述核酸构建体的其余部分连接的5
’
至5
’
连接，并且其中所述第二序列被配置为在所述聚合酶催化的链延伸中是不可延伸的。91.使用权利要求78
‑
90中任一项的所述核酸构建体进行所述聚合酶催化的链延伸的方法，包括：a)提供包含所述核酸构建体、所述模板核酸分子、聚合酶的反应混合物，其中所述核酸构建体至少包含所述第一序列；b)使所述反应混合物经受用于所述聚合酶催化的链延伸的条件，从而进行所述聚合酶催化的链延伸；和
c)用光的光子辐射所述反应混合物或所述核酸构建体，从而终止所述聚合酶催化的链延伸。92.如权利要求91所述的方法，还包括：在c)中，切割所述一个或多个可光裂解部分。93.如权利要求91或权利要求92所述的方法，还包括：在c)中，在所述辐射后形成所述核酸分子，其中所述核酸分子与所述模板核酸分子解离。9...
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。