绿色荧光蛋白鲨源纳米抗体、制备方法及其应用技术

本发明专利技术公开了一种绿色荧光蛋白鲨源纳米抗体、制备方法及其应用。纳米抗体核苷酸序列如SEQ ID NO：1

【技术实现步骤摘要】
ID NO.7或SEQ ID NO.8或SEQ ID NO.9或SEQ ID NO.10或SEQ ID NO.11或SEQ ID NO.12所示。
[0009]所述鲨源纳米抗体在绿色荧光蛋白的亲和纯化、免疫学检测、细胞成像等领域的应用。
[0010]二、一种绿色荧光蛋白鲨源纳米抗体的制备方法，所述鲨源纳米抗体的制备方法按照以下步骤进行：
[0011]1)制备绿色荧光蛋白；
[0012]2)免疫条纹斑竹鲨；
[0013]3)构建噬菌体抗体文库；
[0014]4)筛选特异性纳米抗体；
[0015]5)抗体重组表达。
[0016]所述绿色荧光蛋白的制备是将绿色荧光蛋白的基因由原核或真核系统重组表达及纯化所得。
[0017]所述免疫条纹斑竹鲨具体为：
[0018]S1、将绿色荧光蛋白溶液与弗氏完全佐剂以体积比1:1混合，待乳化完全后，皮下注射入条纹斑竹鲨侧鳍，此为第一次免疫；
[0019]S2、此后，每间隔7～28天加强免疫，每次加强免疫是将绿色荧光蛋白溶液与弗氏不完全佐剂以体积比1:1混合，待乳化完全后，皮下注射入条纹斑竹鲨侧鳍；
[0020]S3、重复上述免疫次数共为4～6次，单次免疫剂量为每只条纹斑竹鲨25～50μg。
[0021]所述构建噬菌体抗体文库具体为：
[0022]3.1)末次免疫结束后3～14天，利用质量分数为0.1％的麻醉剂MS
‑
222喷洒条纹斑竹鲨的口鼻和鳃，使其麻醉，再经尾静脉采集条纹斑竹鲨的外周血，对外周血离心收集淋巴细胞溶液，从淋巴细胞溶液中提取总RNA并反转录为cDNA；
[0023]3.2)以cDNA为模板，用高保真酶扩增获得VNAR片段；
[0024]3.3)以pR2噬菌粒为模板，用高保真酶扩增pR2噬菌粒，利用内切酶酶切pR2噬菌粒；
[0025]3.4)将VNAR片段与酶切之后的pR2噬菌粒通过无缝克隆连接，电转化感受态细菌，稀释涂布细菌，将细菌刮板冻存，即为噬菌体抗体文库。
[0026]具体实施中，可计数噬菌体抗体文库的文库大小，若文库大小小于预设的阈值，则舍弃重新处理制备。
[0027]所述筛选特异性纳米抗体具体为：
[0028]4.1)活化噬菌体抗体文库的菌株，加入辅助噬菌体，经静置培养和离心收集菌体后，将菌体震荡培养过夜；
[0029]4.2)利用PEG沉淀法富集噬菌体获得富集的噬菌体，计算富集的噬菌体的滴度；
[0030]4.3)包被0.1mg/mL绿色荧光蛋白于96孔免疫板的一个孔中作为绿色荧光蛋白组，设置未包被蛋白的一个孔作为阴性对照孔，两个孔均根据噬菌体滴度加入富集的噬菌体，使噬菌体与免疫板上的蛋白结合，经多次洗涤，用胰酶洗脱得到特异性结合的噬菌体；
[0031]具体是将绿色荧光蛋白加入免疫板的孔中，再将富集的噬菌体加入到带有绿色荧光蛋白的免疫板的孔中。
[0032]4.4)将特异性结合的噬菌体侵染TG1细菌，稀释涂布平板，培养获得单菌落，并计数绿色荧光蛋白组与阴性对照组的菌落数量，使得绿色荧光蛋白组菌落大于阴性对照组菌落的数量；
[0033]阴性菌落是指板上的孔没有绿色荧光蛋白处理后的菌落，阳性菌落是指板上的孔有绿色荧光蛋白处理后的菌落。
[0034]4.5)挑取绿色荧光蛋白组单菌落于96孔板中，再加入辅助噬菌体，扩增得到单克隆噬菌体；
[0035]4.6)再次包被1μg/mL低浓度的绿色荧光蛋白于免疫板中，设置未包被蛋白的孔为阴性对照孔，两组均加入单克隆噬菌体，使噬菌体与免疫板上的蛋白结合；加入辣根过氧化物酶标记的噬菌体特异性抗体，用底物进行显色，测定显色后溶液的吸光度，筛选出阳性菌落，从而获得绿色荧光蛋白特异性的抗体序列。此处的阳性是指OD
450
大于1.0。
[0036]具体实施还利用测序引物对阳性菌落进行测序分析，多序列比对并剔除重复序列，确定绿色荧光蛋白特异性的抗体序列，具体如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.6所示。
[0037]所述测序引物具体为：5
’‑
CCCTCATAGTTAGCGTAACGA
‑3’
，如SEQ ID NO.13所示。
[0038]所述内切酶具体为Nco I和Not I。
[0039]所述无缝克隆连接具体为：连接体系共100μL，包含50μL无缝克隆连接酶、0.5pmol pR2噬菌粒、2pmol VNAR片段，其中pR2噬菌粒和VNAR片段体积共50μL；连接反应条件为50℃水浴1h。
[0040]所述辅助噬菌体具体采用为KM13、M13K07、VCSM13、R408等。
[0041]所述抗体重组表达具体为：将抗体序列构建到原核或真核表达载体中，诱导表达重组蛋白，以亲和层析柱纯化抗体。
[0042]具体实施中，还进一步进行绿色荧光蛋白与抗体相互作用关系研究，抗体亲和力测定。
[0043]本专利技术的纳米抗体核苷酸序列如SEQ ID NO：1
‑
6，氨基酸序列如SEQ ID NO：7
‑
12；制备是将绿色荧光蛋白免疫条纹斑竹鲨，提取外周血淋巴细胞总RNA并反转录为cDNA；扩增VNAR片段，并与噬菌粒连接，构建噬菌体抗体文库；从文库中筛选绿色荧光蛋白特异性的纳米抗体序列并重组表达，获得靶向绿色荧光蛋白的鲨源纳米抗体。
[0044]本专利技术与现有技术相比，具有以下优点：
[0045]本专利技术的纳米抗体来源于条纹斑竹鲨，其分子量小、稳定性强、组织穿透能力强以及可识别隐藏抗原表位，可用于绿色荧光蛋白的亲和纯化、免疫学检测、分子成像、免疫传感探针等领域。
[0046]所述鲨源纳米抗体筛选仅需要3～5条鲨鱼，所述纳米抗体蛋白可通过重组表达系统大量获取，抗体表达量高，制备成本低，且稳定性强。因此本专利技术解决了现有传统的人源单抗分子量大、制备困难、操作复杂等缺点。
附图说明
[0047]图1是绿色荧光蛋白免疫鲨鱼方案示意图。
[0048]图2是单克隆噬菌体ELISA结果图。
[0049]图3是所述纳米抗体氨基酸序列比对结果图。
[0050]图4是所述纳米抗体Fc融合蛋白的SDS
‑
PAGE凝胶电泳结果图。泳道M为标准蛋白。
[0051]图5是采用BLI表征所述纳米抗体与绿色荧光蛋白之间的亲和力示意图。其中实线是实时监测的动力学曲线，虚线是软件拟合的曲线。不同绿色荧光蛋白浓度梯度的动力学曲线从上到下与右侧标识的从上到下的浓度依次对应。
[0052]图6是采用pull
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down实验表征所述纳米抗体与绿色荧光蛋白结合的结果图。
[0053]图7是采用BLI表征所述纳米抗体表位竞争关系结果图。
具体实施方式
[0054]下面结合附图及具体实施例对本专利技术作进一步详细说明，以下实施例是对本专利技术的解释而本专利技术并本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种绿色荧光蛋白鲨源纳米抗体，其特征在于：所述鲨源纳米抗体的核苷酸序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.5或SEQ ID NO.6所示。2.权利要求1所述的绿色荧光蛋白鲨源纳米抗体的应用，其特征在于：所述鲨源纳米抗体在绿色荧光蛋白的亲和纯化、免疫学检测、细胞成像等领域的应用。3.一种权利要求1或2所述绿色荧光蛋白鲨源纳米抗体的制备方法，其特征在于：所述鲨源纳米抗体的制备方法按照以下步骤进行：1)制备绿色荧光蛋白；2)免疫条纹斑竹鲨；3)构建噬菌体抗体文库；4)筛选特异性纳米抗体；5)抗体重组表达。4.根据权利要求3所述的绿色荧光蛋白鲨源纳米抗体的制备方法，其特征在于：所述免疫条纹斑竹鲨具体为：S1、将绿色荧光蛋白溶液与弗氏完全佐剂以体积比1:1混合，待乳化完全后，皮下注射入条纹斑竹鲨侧鳍，此为第一次免疫；S2、此后，每间隔7～28天加强免疫，每次加强免疫是将绿色荧光蛋白溶液与弗氏不完全佐剂以体积比1:1混合，待乳化完全后，皮下注射入条纹斑竹鲨侧鳍；S3、重复上述免疫次数共为4～6次，单次免疫剂量为每只条纹斑竹鲨25～50μg。5.根据权利要求3所述的绿色荧光蛋白鲨源纳米抗体的制备方法，其特征在于：所述构建噬菌体抗体文库具体为：3.1)末次免疫结束后3～14天，利用麻醉剂MS
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222喷洒条纹斑竹鲨的口鼻和鳃，使其麻醉，再经尾静脉采集条纹斑竹鲨的外周血，对外周血离心收集淋巴细胞溶液，从淋巴细胞溶液中提取总RNA并反转录为cDNA；3.2)以cDNA为模板，用高保真酶扩增获得VNAR片段；3.3)以pR2噬菌粒为模板，用高保真酶扩增pR2噬菌粒，利用内切酶酶切pR2噬菌粒；3.4)将VNAR片段与酶切之后的pR2噬菌粒通过无缝克隆连接，电转化感受态细菌，稀释涂布细菌，将细菌刮板冻存，即为噬菌体抗体...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈玉磊，解鑫鑫，曹敏杰，金腾川，谢仰杰，马欢，
申请(专利权)人：集美大学，
类型：发明
国别省市：