一种抗HFABP单克隆抗体及其应用制造技术

本发明专利技术公开了抗HFABP的单克隆抗体及其应用。通过将表达的HFABP作为抗原免疫BALB/c小鼠，筛选获得抗人HFABP蛋白的17株单克隆抗体，并对各株单克隆抗体进行磁珠和碱性磷酸酶的标记及配对，获得了能够实现最佳检测效果的配对抗体，进一步对配对的抗体进行了重链以及轻链的序列测定，通过常规方法分析获得了抗体的重链以及轻链的CDR序列。将制备的抗体应用于化学发光酶免疫分析方法（CLEIA）可以准确地定量检测出病人标本中HFABP的含量，可以用于心肌损伤得早期发现及监测心肌缺血性损伤，具有特异性强、灵敏度高、准确性好，快速简便等优点。点。

【技术实现步骤摘要】
一种抗HFABP单克隆抗体及其应用


[0001]本专利技术属于免疫学领域，具体涉及一种抗HFABP的单克隆抗体及其制备方法与应用。

技术介绍

[0002]人类心脏型脂肪酸结合蛋白( HFABP)是一种15 kDa的低分子量蛋白，由132个氨基酸组成。主要位于心脏，占细胞溶质蛋白库的5
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15%，这些蛋白质参与细胞内长链脂肪酸的运输，是心脏向线粒体输送能量的主要来源。H
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FABP主要存在于心肌细胞中，健康人体血清或血浆中正常范围在0.0至5.5纳克/毫升之间。在急性心肌梗死过程中，心肌细胞受损，它可以迅速释放到血浆中，1
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3h就可以检测到，6
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8h达到峰值，12
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24h就可以恢复正常，HFABP 的这些特性有助于更全面对AMI进行诊断和治疗，使它成为检测AMI的新兴生物标志物。
[0003]目前，对于AMI的临床诊断常用指标有肌红蛋白、肌钙蛋白和肌酸激酶及其同工酶等。但这些指标只有心肌坏死数小时后才升高，而在AMI 的早期诊断方面，HFABP在心肌损伤后的前6小时内异常敏感，甚至可以在1小时检测到。其敏感性和特异性都比 cTnI、CK
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MB 更好，但在 6h 后，准确率逐步降低。因此 HFABP 与 cTnI 等其他标志物检测相结合，可以有效提高临床诊断的准确性。此外，HFABP还与AMI患者的白细胞增多等其他临床参数相关。因此，HFABP可以作为 AMI 早期诊断、风险评估和预后判断的一种更好的生化指标。
[0004]在临床上，HFABP的检测方法包括放射免疫分析法(RIA)、乳胶比浊免疫分析法(LTIA) 、酶联免疫吸附分析法(ELISA)和胶体金免疫层析法等。这些方法主要存在费用高，假阳性以及灵敏度不高等缺点。
[0005]本研究旨在开发针对HFABP的高亲和力和高特异性单克隆抗体（mAbs），然后建立一种基于磁性粒子的化学发光酶免疫分析方法（CLEIA），其低成本，低成本的平台可用于快速准确的对HFABP定量。为了评估开发的单克隆抗体和CLEIA的应用前景，将CLEIA测定的血清HFABP值与医院检测的临床值进行比较。

技术实现思路

[0006]本专利技术提供了一种抗HFABP单克隆抗体，所述单克隆抗体的重链可变区的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:1、2和3所示；和所述单克隆抗体的轻链可变区的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:4、5和6所示。
[0007]优选的，所述单克隆抗体的重链可变区氨基酸序列分别如SEQ ID NO:14所示；和所述单克隆抗体的轻链可变区的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:16所示。
[0008]优选的，所述编码单克隆抗体重链的核苷酸分子序列如SEQ ID NO:13所示，所述编码单克隆抗体轻链的核苷酸分子序列如SEQ ID NO:15所示。
[0009]本专利技术也提供了一种抗HFABP单克隆抗体，所述单克隆抗体的重链可变区的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:7、8和9所示；和所述单克隆抗体的轻链可变区
的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:10、11和12所示。
[0010]优选的，所述单克隆抗体的重链可变区氨基酸序列分别如SEQ ID NO:18所示；和所述单克隆抗体的轻链可变区的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:20所示。
[0011]优选的，所述的单克隆抗体，还包括恒定区，所述单克隆抗体的重链的恒定区为IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的任意一种；所述单克隆抗体的轻链的恒定区为κ型或λ型。
[0012]优选的，本专利技术公开了编码所述的单克隆抗体的核苷酸分子。
[0013]优选的，所述编码单克隆抗体重链的核苷酸分子序列如SEQ ID NO:17所示，所述编码单克隆抗体轻链的核苷酸分子序列如SEQ ID NO:19所示。
[0014]本专利技术公开了一种表达载体，所述表达载体包含所述的核苷酸分子。
[0015]本专利技术公开了一种细胞，所述细胞包含所述的载体。
[0016]本专利技术公开了一种单克隆抗体，所述单克隆抗体由所述的细胞表达获得。
[0017]本专利技术公开了一种所述的单克隆抗体在制备检测HFABP的试剂盒中的用途。
[0018]优选的，所述试剂盒为化学发光酶免疫分析试剂盒。
[0019]本专利技术公开了一种检测HFABP的化学发光酶免疫分析试剂盒，所述试剂盒包括所述的单克隆抗体。
[0020]为实现上述技术方案，针对现有技术的不足，本专利技术人利用原核表达技术表达并纯化人HFABP蛋白。纯化后的人HFABP蛋白具有很高的纯度，用于免疫BALB/c小鼠，通过杂交瘤技术，经过四次筛选，获得17株稳定分泌抗人HFABP蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞，并进行磁珠和碱性磷酸酶的标记及配对，建立一种既安全又可快速准确的检测出待测样本中心型脂肪酸结合蛋白含量的化学发光酶免疫分析方法（CLEIA）。
[0021]本专利技术采用的技术方案是：建立一种检测HFABP的化学发光酶免疫分析方法（CLEIA），包括：本专利技术制备的抗人心型脂肪酸结合蛋白的单克隆抗体、用于检测心型脂肪酸结合蛋白的磁珠偶联抗体以及碱性磷酸酶标记抗体。
[0022]所述的心型脂肪酸结合蛋白免疫检测试剂，包括：抗人HFABP单克隆抗体；磁珠偶联物和酶标偶联物；上述磁珠偶联物由磁珠与抗人心型脂肪酸结合蛋白的单克隆抗体偶联形成；上述酶标偶联物由碱性磷酸酶标记抗人心型脂肪酸结合蛋白的单克隆抗体形成。
[0023]本专利技术公开了一种心型脂肪酸结合蛋白免疫检测试剂的制备方法。
[0024]本专利技术公开了抗人心型脂肪酸结合蛋白的单克隆抗体的制备方法，包括：（1）将纯化的重组HFABP蛋白与弗氏完全佐剂充分乳化，采用皮下免疫方法，取 5 只 4
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6 周龄的BALB/c雌鼠分别以 100
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g/只的剂量进行初次免疫；（2）两周后进行第2次免疫，将人HFABP蛋白与弗氏不完全佐剂充分乳化，采用与步骤（1）中同样的剂量和方法加强免疫BALB/c小鼠；（3）每次间隔 2 周，采用与步骤（1）中同样的剂量和方法加强免疫BALB/c小鼠，总共进行四次免疫；（4）融合前3 d用不加佐剂的人HFABP抗原进行脾脏加强免疫，每只剂量50 μg；（5）小鼠眼角进行采血，4 ℃，4000 g离心5 min，取上清，间接ELISA法检测血清效价，选取血清效价大于1，000，000的小鼠准备进行细胞融合试验；（6）选择生长状态良好的SP2/0骨髓瘤细胞与免疫小鼠的脾脏细胞以1:5~1:10混合，1500 g离心5 min，收集细胞沉淀，弃上清；
（7）轻摇离心管使细胞均匀分散，缓缓加入1 mL37 ℃预热的PEG 1500并轻轻混匀1.5 min，然后加入2本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.抗HFABP单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体的重链可变区的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:1、2和3所示；和所述单克隆抗体的轻链可变区的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:4、5和6所示；或，所述单克隆抗体的重链可变区的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:7、8和9所示；和所述单克隆抗体的轻链可变区的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:10、11和12所示。2.根据权利要求1所述的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体的重链可变区氨基酸序列分别如SEQ ID NO:14所示；和所述单克隆抗体的轻链可变区的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:16所示；或，所述单克隆抗体的重链可变区氨基酸序列分别如SEQ ID NO:18所示；和所述单克隆抗体的轻链可变区的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:20所示。3.根据权利要求1
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2任一所述的单克隆抗体，还包括恒定区，所述单克隆抗体的重链的恒定...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘如石，郑姣，邱义兰，
申请(专利权)人：刘如石，
类型：发明
国别省市：