干血片中甲基丙二酸、甲基枸橼酸、蛋氨酸和总同型半胱氨酸含量快速检测方法和试剂盒技术

本发明专利技术公开了一种干血片中甲基丙二酸、甲基枸橼酸、蛋氨酸和总同型半胱氨酸含量快速检测方法和试剂盒。本发明专利技术采用非衍生化方法，采用UPLC

【技术实现步骤摘要】
干血片中甲基丙二酸、甲基枸橼酸、蛋氨酸和总同型半胱氨酸含量快速检测方法和试剂盒


[0001]本专利技术属于生化检测
，具体涉及一种干血片中甲基丙二酸、甲基枸橼酸、蛋氨酸和总同型半胱氨酸含量快速检测方法和试剂盒。

技术介绍

[0002]新筛中根据蛋氨酸和C3的含量异常来有针对性地筛查丙酸、蛋氨酸、维生素B12(vitamin B12，钴胺素，cobalamin,Cbl)代谢有关的先天性缺陷。美国医学遗传学会颁布了新筛的初筛中需要被鉴别诊断的遗传病主要有29种先天性遗传病，另外还有次要的25种先天性遗传病。其中4种主要疾病和2种次要疾病与C3和Met浓度的异常增高有关。
[0003]甲基丙二酸血症(methylmalonic academia,MMA)是一种常染色体隐性遗传病，主要是由于甲基丙二酰辅酶A变位酶自身缺陷或其辅酶钴胺素(cobalamin,cbl,维生素B12)代谢缺陷，导致甲基丙二酸、3
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羟基丙酸及甲基枸橼酸等代谢物异常蓄积引起的疾病。根据酶缺陷类型分为甲基丙二酰辅酶A变位酶缺陷(Mut型)及其辅酶钴胺素代谢障碍两大类。钴胺素代谢障碍包括6个类型，分别为cblA、cblB、cblC、cblD、cblF、cblH。
[0004]丙酸血症(propionic academia,PA)是支链氨基酸和奇数链脂肪酸代谢导致的一种较常见的有机酸血症，属于常染色体隐性遗传代谢病，是由于丙酰辅酶A羧化酶活性缺乏，导致体内丙酸及其代谢产物前体异常蓄积，出现一系列生化异常、神经系统及其他脏器损害症状。PA是由于丙酰辅酶A羧化酶活性缺陷导致丙酰辅酶A转化为甲基丙酰辅酶A受阻，进而引起丙酰辅酶A、丙酰肉碱、丙酸、3
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羟基丙酸、甲基枸橼酸和丙酰甘氨酸等代谢产物异常增高，引起机体损伤。
[0005]同型半胱氨酸血症(homocysteinemia,HCY)是含硫氨基酸蛋氨酸(甲硫氨酸)代谢过程中由于某种酶缺乏导致血浆同型半胱氨酸浓度增高，而同型半胱氨酸是动脉粥样硬化、急性心肌梗死、脑卒中、冠状动脉病变以及与外周血管病变能发病的独立危险因子。该病属于常染色体隐性遗传性疾病。临床表现多种多样，主要表现为晶状体脱落、血管病变、骨骼异常和智力低下。同型半胱氨酸血症可因胱硫醚β合成酶(cystathionine beta
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synthase,CBS)缺乏、甲钴胺素代谢缺陷导致甲硫氨酸合酶(methionine synthase,MS)缺乏(包括甲基丙二酸血症合并同型胱氨酸尿症)及亚甲基四氢叶酸还原酶(methylenetetrahydrofolate reductase,MTHFR)缺乏所致，前两者较多见。
[0006]单纯性高甲硫氨酸血症(isolated hypermethioninemia)是由于体内甲硫氨酸降解过程受阻导致血甲硫氨酸过多引起疾病。肝脏疾病、酪氨酸血症Ⅰ型、经典型通行同型胱氨酸血症、过多摄入甲硫氨酸等也可引起继发性高蛋氨酸血症。原发性高甲硫氨酸血症主要由于甲硫氨酸S
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腺苷转移酶(methionine adenosyltransferaseⅠ/Ⅲ,MATⅠ/Ⅲ)缺乏所致，甘氨酸N
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甲基转移酶(glycine N
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methyltransferase,GNMT)缺乏及S
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腺苷同型半胱氨酸水解酶(S
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adenosylhomocysteine hydrolase,AHCY)缺乏也可导致高甲硫氨酸血症。呈常染色体隐性遗传，少数为常染色体显性遗传。多数患者无临床表现，少数有智力减退及其
他神经系统症状。
[0007]丙酸、蛋氨酸、维生素B12代谢相关的先天性缺陷更具有特异性的指标是甲基丙二酸、甲基枸橼酸、总同型半胱氨酸、3
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羟基丙酸，理想的状况是把这几个指标加入到新筛项目中，但是检测甲基丙二酸、甲基枸橼酸、总同型半胱氨酸这3种物质的含量用到了LC
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MS/MS方法，每针进样之间的走样时长较长，且需要色谱分离，这样才能准确地分离识别和定量甲基丙二酸、甲基枸橼酸、总同型半胱氨酸这3种物质的含量，尤其是要分离同分异构体甲基丙二酸和丁二酸。所以把这几个指标加入到新筛项目中不具有可实践性。所以最好的方法便是发展二次筛查的工作。即新筛中初筛时检测出C3和Met浓度异常的血斑样本，用LC
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MS/MS的方法再检测其甲基丙二酸、甲基枸橼酸、总同型半胱氨酸含量。
[0008]目前，使用LC
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MS/MS的方法检测生物样本中的甲基丙二酸、甲基枸橼酸、总同型半胱氨酸，其前处理方法分为衍生法和非衍生法。衍生法中，通过萃取液萃取样本中的物质后，需要将样本溶液的溶剂去除，再使用衍生化试剂(3N盐酸正丁醇)进行反应，然后去除多余的衍生化试剂后，才能对目标化合物的衍生化产物进行间接检测，进而分析样本中目标化合物的含量。衍生操作可有助于同分异构体甲基丙二酸和丁二酸的液相分离，且提高检测灵敏度，但是衍生化前处理衍生步骤复杂，衍生化试剂具有毒性和刺激性，且衍生化试剂稳定性差、成本高，开发一种前处理方法简便、分离度良好和方法稳定的廉价非衍生化方法是非常有必要的。

技术实现思路

[0009]本专利技术的目的是克服现有技术的不足，提供了一种干血片中甲基丙二酸、甲基枸橼酸、蛋氨酸和总同型半胱氨酸含量快速检测方法和试剂盒。本专利技术旨在克服现有衍生化方法存在的问题，并通过HPLC
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MS/MS检测方法的优化，将甲基丙二酸与琥珀酸实现基线分离，提交定量准确性，并缩短检测时间。
[0010]本专利技术首先提供了一种干血片中甲基丙二酸、甲基枸橼酸、蛋氨酸和总同型半胱氨酸含量快速检测方法，其包括如下步骤：
[0011]1)将血斑样本经过提取、还原和浓缩，得到待测样品；
[0012]2)采用UPLC
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MS/MS技术对样品进行内标法定量分析，使用6个水平的血斑做校正线，以以标准品溶液和内标浓度比为X轴，标准品和内标峰面积比为Y轴；进行线性回归分析得回归方程，将相应氨待测物质面积代入回归方程，计算样本中待测物质的浓度；
[0013]所述UPLC
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MS/MS技术中，以体积百分比计，液相方法所使用的流动相A为：5％甲醇水+0.3％甲酸，流动相B为：85％甲醇+10％异丙醇+0.3％甲酸水溶液，液相方法所使用的梯度洗脱程序为0
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0.35min，100％A；0.35
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0.4min 100％A渐变为0％A；0.4
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1.5min，0％A；1.5
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1.51min，0％A渐变为100％A；1.51
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3min，100％A；
[0014]质谱方法为同时进行正离子和负离子电喷雾离子化的多离子反应检测模式，待测物为甲基丙二酸(MMA)、甲基枸橼酸(MCA)、总同型半胱氨本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种干血片中甲基丙二酸、甲基枸橼酸、蛋氨酸和总同型半胱氨酸含量快速检测方法，其特征在于包括如下步骤：1)将血斑样本经过提取、还原和浓缩，得到待测样品；2)采用UPLC
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MS/MS技术对样品进行内标法定量分析，使用6个水平的血斑做校正线，以以标准品溶液和内标浓度比为X轴，标准品和内标峰面积比为Y轴；进行线性回归分析得回归方程，将相应氨待测物质面积代入回归方程，计算样本中待测物质的浓度；所述UPLC
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MS/MS技术中，以体积百分比计，液相方法所使用的流动相A为：5％甲醇水+0.3％甲酸，流动相B为：85％甲醇+10％异丙醇+0.3％甲酸水溶液，液相方法所使用的梯度洗脱程序为0
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0.35min，100％A；0.35
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0.4min 100％A渐变为0％A；0.4
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1.5min，0％A；1.5
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1.51min，0％A渐变为100％A；1.51
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3min，100％A；质谱方法为同时进行正离子和负离子电喷雾离子化的多离子反应检测模式，待测物为甲基丙二酸(MMA)、甲基枸橼酸(MCA)、总同型半胱氨酸(tHCY)和蛋氨酸(MET)，琥珀酸(SA)，内标为d3
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甲基丙二酸、d3
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甲基枸橼酸、d4
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同型半胱氨酸和d3
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蛋氨酸；质谱采集参数如下所示：2.根据权利要求1所述的干血片中甲基丙二酸、甲基枸橼酸、蛋氨酸和总同型半胱氨酸含量快速检测方法，其特征在于，所述的步骤1)，具体为：在干血斑上将滤纸片打孔，将滤纸血片移入U型微孔板内，使用多道移液器给每个含有滤纸血片的板孔内，每个孔加入3个干滤纸血斑；给每个含有滤纸血片的板孔内添加200μL的工作液，用铝箔封套覆盖微孔板；在45℃条件下震荡30分钟，震荡的速度为600rpm，震荡完成后转移150μL上清液至另一洁净的U型微孔板内，使用氮气在40℃条件下吹干，然后用40μL复溶液复溶后准备上样分析。3.根据权利要求2所述的干血片中甲基丙二酸、甲基枸橼酸、蛋氨酸和总同型半胱氨酸含量快速检测方法，其特征在于，所述工作液为包含如下浓度或体积百分数物质的水溶液：...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴敏航，蔡露露，陈湘悦，张玉，
申请(专利权)人：杭州博圣医学检验实验室有限公司杭州杰毅麦特医疗器械有限公司，
类型：发明
国别省市：