一种血清中全谱维生素的检测方法技术

本发明专利技术公开了一种血清中全谱维生素的检测方法，涉及代谢组分析技术领域，其先向样本中加入同位素维生素作为内标，再通过固

【技术实现步骤摘要】
一种血清中全谱维生素的检测方法


[0001]本专利技术涉及代谢组分析
，更具体地说是指一种血清中全谱维生素的检测方法。

技术介绍

[0002]全谱维生素包含B族水溶性维生素和脂溶性维生素，B族水溶性维生素是推动体内所有物质转化为能量的基本物质，它参与蛋白质、碳水化合物和脂肪的代谢，还是促进人体新陈代谢的必要物质。脂溶性维生素包括维生素A、D、E、K，维生素A对于维持正常视力、上皮细胞组织健康和免疫功能具有重要的作用。维生素D不仅仅影响钙磷代谢，而且具有广泛的生理作用，是维持人体健康、细胞生长和发育的必不可少的物质。维生素E的主要生理作用是抗氧化。维生素K缺乏后会凝血障碍，是促进血液正常凝固及骨骼生长的重要维生素。
[0003]目前采用LC
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MS方法对全谱维生素进行定量分析常用的策略是使用不同的提取方法和检测方法对水溶性维生素和脂溶性维生素分别进行定量，若需检测全谱维生素，则需准备两份样本，采用两种方法检测，操作繁琐，效率低，耗费大。

技术实现思路

[0004]本专利技术提供的一种只需一个样本就可以完成血清中全谱维生素检测的定量检测方法，其目的在于解决现有技术中存在全谱维生素需要准备两份样本，采用两种方法进行分别检测，操作繁琐，效率低等的问题。
[0005]本专利技术采用的技术方案如下：
[0006]一种血清中全谱维生素的检测方法,其特征在于：先向血清样品加入同位素维生素作为内标；再通过固
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液萃取法分别提取血清样本中的水溶性维生素和脂溶性维生素；使用T3色谱将维生素分离后，采用分段两次进样一次分析，内标矫正标曲进行串联质谱分析。
[0007]进一步，具体包括以下步骤：
[0008]步骤S1、配制内标溶液；用水溶性维生素的同位素内标、0.3％甲酸水溶液和水制得IS
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mixA混合内标溶液；用脂溶性维生素的同位素内标和纯甲醇制得IS
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mixB混合内标溶液。
[0009]步骤S2、配制标准品溶液；用水溶性维生素标准品、0.3％甲酸水溶液和水制得mixA标准品溶液；用脂溶性维生素标准品和纯甲醇制得mixB标准品溶液。
[0010]步骤S3、构建标准曲线；使用人血清蛋白溶液将mixA标准品溶液分梯度稀释，得到若干浓度不同的mixA稀释溶液；使用人血清蛋白溶液将mixB标准品溶液分梯度稀释，得到若干浓度不同的mixB稀释溶液；将浓度相同的mixA稀释溶液和mixB稀释溶液混合，得到若干浓度不同的混合液；再对每份混合液做如下处理：加入IS
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mixA混合内标溶液和IS
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mixB混合内标溶液并涡旋混合；再加入甲醇/乙腈混合液并涡旋混合；待沉淀蛋白后再加入金标水并涡旋混合；用离心机离心后，取上清液过Ostro SPE板，收集过滤液于A离心管，得到滤液A1；再加入纯甲醇并涡旋混合，再过Ostro SPE板，收集过滤液于B离心管，并用异丙醇解
吸附在Ostro SPE板上的脂溶性维生素，同样收集过滤液于B离心管，得到滤液B1；滤液A1使用真空干燥，再用0.3％甲酸水溶液复溶，再用离心机离心后取上清液，得到上清液A1；滤液B1使用氮气吹干，再用纯甲醇复溶，再用离心机离心后取上清液，得到上清液B1；对上清液A1、上清液B1进行分段两次进样一次LC
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MS/MS分析，得到标准曲线。
[0011]步骤S4、样品分析；取血清样本，加入IS
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mixA混合内标溶液和IS
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mixB混合内标溶液并涡旋混合；再加甲醇/乙腈混合液并涡旋混合，待沉淀蛋白后再加入金标水并涡旋混合；再用离心机离心后，取上清液过Ostro SPE板，收集过滤液于A离心管，得到滤液A2；再加入纯甲醇并涡旋混合；过Ostro SPE板，收集过滤液于B离心管，加入异丙醇解吸附Ostro SPE板上的脂溶性维生素，同样收集过滤液于B离心管，得到滤液B2；滤液A2使用真空干燥，再用0.3％甲酸水溶液复溶，用离心机离心后取上清液，得到上清液A2；滤液B2使用氮气吹干，再用纯甲醇复溶，用离心机离心后取上清液，得到上清液B2；对上清液A2和上清液B2进行分段两次进样一次LC
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MS/MS分析；将分析结果使用步骤S3构建的标准曲线换算出对应维生素浓度。
[0012]更进一步，所述步骤S1具体是：称取水溶性维生素的同位素内标，向其中加入0.3％甲酸水溶液溶解制成10μg/ml的溶液，再取40μL该溶液用水稀释定容至1ml，制得浓度为400ng/ml的所述IS
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mixA混合内标溶液；称取脂溶性维生素的同位素内标，向其中加入纯甲醇溶解制成10μg/ml的溶液，再取40μL该溶液用纯甲醇稀释定容至1ml，制得浓度为400ng/ml的所述IS
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mixB混合内标溶液。
[0013]更进一步，所述步骤S2具体是：称取水溶性维生素标准品，向其中加入0.3％甲酸水溶液溶解制成1mg/ml的水溶性维生素标准品母液，再取40μL该母液用水稀释定容至1ml，制得浓度为25μg/ml的所述mixA标准品溶液；称取脂溶性维生素标准品，向其中加入纯甲醇溶解制成1mg/ml的脂溶性维生素标准品母液，再取40μL该母液用纯甲醇稀释定容至1ml，制得浓度为25μg/ml的所述mixB标准品溶液。
[0014]更进一步，所述步骤S1中，水溶性维生素的同位素内标包括Nicotinamide
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13C6(C13烟酰胺)、Pyrioxine
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d3(氘代吡哆醇)和Folic acid
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13C5(C13叶酸)。脂溶性维生素的同位素内标包括25
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OH Vitamin D2
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d3(氘代25
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羟基维生素D2)、25
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OH Vitamin D3
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d3(氘代25
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羟基维生素D3)和Vitamin K1
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d7(氘代维生素K1)；步骤S2中，水溶性维生素标准品包括Thiamine nitrate(具体为Vitamin B1)、Riboflavine(具体为Vitamin B2)、Nicotinamide(具体为Vitamin B3)、Niacin acid(具体为Vitamin B3)、Pyridoxine(具体为Vitamin B6)、Pyridoxal(具体为VitaminB6)、Folic acid(具体为Vitamin B9)、CyanocobalaMin(具体为Vitamin B12)，所述脂溶性维生素标准品包括Vitamin A、25
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OH Vitamin D2、25
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OH Vitamin D3、Vitamin E、Vitamin K1。
[0015]更进一步，所述步骤S3中，mixA标准品溶液和mixB标准品本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种血清中全谱维生素的检测方法,其特征在于：先向血清样品加入同位素维生素作为内标；再通过固
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液萃取法分别提取血清样本中的水溶性维生素和脂溶性维生素；使用T3色谱将维生素分离后，采用分段两次进样一次分析，内标矫正标曲进行串联质谱分析。2.根据权利要求1所述的一种血清中全谱维生素的检测方法,其特征在于：具体包括以下步骤：步骤S1、配制内标溶液；用水溶性维生素的同位素内标、0.3%甲酸水溶液和水制得IS
‑
mixA混合内标溶液；用脂溶性维生素的同位素内标和纯甲醇制得IS
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mixB混合内标溶液；步骤S2、配制标准品溶液；用水溶性维生素标准品、0.3%甲酸水溶液和水制得mixA标准品溶液；用脂溶性维生素标准品和纯甲醇制得mixB标准品溶液；步骤S3、构建标准曲线；使用人血清蛋白溶液将mixA标准品溶液分梯度稀释，得到若干浓度不同的mixA稀释溶液；使用人血清蛋白溶液将mixB标准品溶液分梯度稀释，得到若干浓度不同的mixB稀释溶液；将浓度相同的mixA稀释溶液和mixB稀释溶液混合，得到若干浓度不同的混合液；再对每份混合液做如下处理：加入IS
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mixA混合内标溶液和IS
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mixB混合内标溶液并涡旋混合；再加入甲醇/乙腈混合液并涡旋混合；待沉淀蛋白后再加入金标水并涡旋混合；用离心机离心后，取上清液过Ostro SPE板，收集过滤液于A离心管，得到滤液A1；再加入纯甲醇并涡旋混合，再过Ostro SPE板，收集过滤液于B离心管，并用异丙醇解吸附在Ostro SPE板上的脂溶性维生素，同样收集过滤液于B离心管，得到滤液B1；滤液A1使用真空干燥，再用0.3%甲酸水溶液复溶，再用离心机离心后取上清液，得到上清液A1；滤液B1使用氮气吹干，再用纯甲醇复溶，再用离心机离心后取上清液，得到上清液B1；对上清液A1、上清液B1进行分段两次进样一次LC
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MS/MS分析，得到标准曲线；步骤S4、样品分析；取血清样本，加入IS
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mixA混合内标溶液和IS
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mixB混合内标溶液并涡旋混合；再加甲醇/乙腈混合液并涡旋混合，待沉淀蛋白后再加入金标水并涡旋混合；再用离心机离心后，取上清液过Ostro SPE板，收集过滤液于A离心管，得到滤液A2；再加入纯甲醇并涡旋混合；过Ostro SPE板，收集过滤液于B离心管，加入异丙醇解吸附Ostro SPE板上的脂溶性维生素，同样收集过滤液于B离心管，得到滤液B2；滤液A2使用真空干燥，再用0.3%甲酸水溶液复溶，用离心机离心后取上清液，得到上清液A2；滤液B2使用氮气吹干，再用纯甲醇复溶，用离心机离心后取上清液，得到上清液B2；对上清液A2和上清液B2进行分段两次进样一次LC
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MS/MS分析；将分析结果使用步骤S3构建的标准曲线换算出对应维生素浓度。3.根据权利要求1所述的一种血清中全谱维生素的检测方法,其特...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈贵生，张陈斌，陈贵丹，连晓兰，陈光辉，
申请(专利权)人：麦特瑞思无锡科技有限公司，
类型：发明
国别省市：