本发明专利技术提供了一种细胞色素P450(CYP716A53v2)突变体蛋白及其应用。本发明专利技术人经过大量的突变研究，确定了与CYP716A53v2酶的催化活性相关的氨基酸位点，通过进行定点改造，获得酶催化活性的大大提高的CYP716A53v2突变体。本发明专利技术还提供了表达所述突变体基因工程细胞。程细胞。
【技术实现步骤摘要】
细胞色素P450突变体蛋白及其应用
[0001]本专利技术涉及生物技术和天然产物药物等领域，具体地，本专利技术涉及一种细胞色素P450(CYP716A53v2)的突变体蛋白及其应用。
技术介绍
[0002]人参皂苷是五加科人参属植物(如人参、三七、西洋参等)中的主要活性物质，近年来在葫芦科植物绞股蓝中也发现一些人参皂苷。目前，国内外科学家已经从人参、绞股蓝等植物中分离出了至少100多种人参皂苷，这些皂苷在人参中的含量差别非常大。其中一些疗效显著的三萜皂苷在天然总皂苷中含量极低(亦被称为稀有皂苷)，由于提取的成本很高，所以价格就非常昂贵。目前多种皂苷已经应用于药品和保健品，如以人参皂苷Rg3单体为主要成分的药物参一胶囊可改善肿瘤患者的气虚症状，提高机体免疫功能；以人参皂苷Rh1等16种稀有人参皂苷混合物为主要成分的瑞得生胶囊可以抑制肿瘤部位新生血管生成，促进癌变细胞凋亡，并降低化疗耐药。
[0003]由于稀有人参皂苷往往具有独特生物活性或更显著疗效，传统制备稀有人参皂苷都是从人参或三七中提取的大量皂苷经过化学水解法、酶法水解和微生物法水解来制备。由于野生的人参资源已基本耗竭，人参总皂苷资源目前主要来源于人参或三七的人工栽培，而其人工栽培的生长周期长(一般需要5-7年以上)，并且受到地域的限制，还经常受到病虫害而需要施用大量的农药，并且人参或三七的人工栽培有严重的连作障碍(人参或三七种植地需要休耕5-15年以上才能克服连作障碍)，所以人参皂苷的产量、品质及安全性都面临挑战。另一方面，以人参总皂苷为原料来制备单一成分的皂苷，因为总皂苷中还有大量的成份无法转化为目标人参皂苷单体(例如原人参三醇型皂苷)无法得到利用，不仅造成资源的浪费，还会增加抽提纯化成本。
[0004]合成生物学的发展为植物来源的天然产物的异源合成提供了新的机遇。以酵母为底盘，通过代谢途径的组装和优化，已经实现了用廉价的单糖来发酵合成青蒿酸或者双氢青蒿酸，继而再通过一步化学转化的方法生产青蒿素，这表明合成生物学在天然产物的药物合成方面具有的巨大潜力。利用酵母底盘细胞通过合成生物学方法异源合成稀有人参皂苷单体，原料为廉价的单糖，制备过程为安全性可调控的发酵过程，避免了任何外来污染(例如，原料植物人工种植时使用的农药)，因此，通过合成生物学技术制备稀有人参皂苷单体，不仅具有成本优势，而且，可以保证成品的品质与安全性。利用合成生物学技术制备足够量的各种高纯度稀有人参皂苷单体，用于活性测定及临床实验，促进稀有人参皂苷的创新药物研发。
[0005]利用合成生物学方法来人工合成具有药用活性的原人参三醇型人参皂苷，首要需要解析与重构原人参三醇PPT的合成代谢途径。由于人参皂苷属于三萜化合物，植物中MVA和MEP代谢途径提供了萜类化合物的共同前体IPP和DMAPP，为三萜化合物前体角鲨烯和2,3-环氧角鲨烯的合成奠定了基础。2006年韩国与日本科学家从人参中分别克隆并鉴定了由环氧角鲨烯转化为达玛烯二醇的合酶DS(Han,J.Y.,et al.,Plant Cell Physiol,2006.47
(12):p.1653-62.；Tansakul,P.,et al.,FEBS Lett,2006.580(22):p.5143-9)，韩国研究者Han JY分别在2011年(Han,J.Y.,et al.,Plant Cell Physiol,2011.52(12):p.2062-73)和2012年(Han,J.Y.,et al.,Plant Cell Physiol,2012.53(9):p.1535-45)从人参的cDNA文库中克隆并鉴定了合成原人参二醇和原人参三醇的关键细胞色素P450，CYP716A47和CYP716A53v2。CYP716A47可以催化达玛烯二醇C12位羟基化生成原人参二醇PPD，CYP716A53v2可以催化原人参二醇C6位羟基化生成原人参三醇PPT。在WAT21酵母中共表达了DS和这两个细胞色素P450以及拟南芥来源的P450还原酶ATR2-1，并获得了可以生产原人参二醇和原人参三醇的重组菌株。进一步研究表明，CYP716A53v2催化原人参二醇向原人参三醇的转化是整个合成途径中的一个关键限速步骤。
[0006]因此，本领域需要对细胞色素P450 CYP716A53v2进行更多的研究和改造，以获得更高效的细胞色素P450蛋白元件从而促进人参皂苷细胞工厂合成效率。
技术实现思路
[0007]本专利技术对细胞色素P450 CYP716A53v2的蛋白编码序列进行了突变和优化获得了新的突变序列，在产原人参二醇的细胞内表达该突变序列可以显著提高原人参三醇的产量。
[0008]在本专利技术的第一方面，提供一种提高细胞色素P450 CYP716A53v2的催化活性的方法，包括：对细胞色素P450 CYP716A53v2的氨基酸序列进行突变，对应于野生型细胞色素P450 CYP716A53v2，突变选自下组的位点或其组合：第167位，第451位，第117位，第208位。
[0009]在一个优选例中，所述氨基酸位置编号基于SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。
[0010]在另一优选例中，第167位突变为Val(V)，第451位突变为Asn(A)，第117位突变为Ser(S)，第208位突变为Cys(C)。
[0011]在本专利技术的另一方面，提供一种细胞色素P450 CYP716A53v2突变体，其是：(a)氨基酸序列对应于野生型细胞色素P450 CYP716A53v2，选自下组的位点或位点组合发生突变的蛋白：第167位，第451位，第117位，第208位(较佳地，它们为核心氨基酸突变)；(b)将(a)蛋白的氨基酸序列经过一个或多个(如1-20个；较佳地1-15个；更佳地1-10个，如5个，3个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有(a)蛋白功能的由(a)衍生的蛋白，但对应于野生型细胞色素P450 CYP716A53v2的第167位，第451位，第117位，第208位的氨基酸与(a)蛋白相应位置突变后的氨基酸相同；(c)与(a)蛋白的氨基酸序列有80％以上(较佳地85％以上；更佳地90％以上；更佳95％以上，如98％，99％)同源性且具有(a)蛋白功能的由(a)衍生的蛋白，但对应于野生型细胞色素P450 CYP716A53v2的第167位，第451位，第117位，第208位的氨基酸与(a)蛋白相应位置突变后的氨基酸相同；或，(d)(a)～(c)任一所述多肽的N或C末端添加标签序列，或在其N末端添加信号肽序列或分泌信号序列后形成的多肽。
[0012]在一个优选例中，所述的细胞色素P450 CYP716A53v2突变体具有显著高于其野生型的催化活性。
[0013]在另一优选例中，所述的细胞色素P450 CYP716A53v2突变体中，第167位突变为Val(V)。
[0014]在另一优选例中，所述的细胞色素P450 CYP716A53v2突变体中，第451位突变为
Asn(A)。
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【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种提高细胞色素P450 CYP716A53v2的催化活性的方法，包括：对细胞色素P450 CYP716A53v2的氨基酸序列进行突变，对应于野生型细胞色素P450 CYP716A53v2，突变选自下组的位点或其组合：第167位，第451位，第117位，第208位。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，第167位突变为Val，第451位突变为Asn，第117位突变为Ser，第208位突变为Cys。3.一种细胞色素P450 CYP716A53v2突变体，其是：(a)氨基酸序列对应于野生型细胞色素P450 CYP716A53v2，选自下组的位点或位点组合发生突变的蛋白：第167位，第451位，第117位，第208位；(b)将(a)蛋白的氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有(a)蛋白功能的由(a)衍生的蛋白，但对应于野生型细胞色素P450 CYP716A53v2的第167位，第451位，第117位，第208位的氨基酸与(a)蛋白相应位置突变后的氨基酸相同；(c)与(a)蛋白的氨基酸序列有80％以上同源性且具有(a)蛋白功能的由(a)衍生的蛋白，但对应于野生型细胞色素P450 CYP716A53v2的第167位，第451位，第117位，第208位的氨基酸与(a)蛋白相应位置突变后的氨基酸相同；(d)(a)～(c)任一所述多肽的N或C末端添加标签序列，或在其N末端添加信号肽序列或分泌信号序列后形成的多肽。4.如权利要求3所述的细胞色素P450 CYP716A53v2突变体，其特征在于，第167位突变为Val，第451位突变为Asn，第117位突变为Ser，第208位突变为Cys。5.如权利要求3或4所述的细胞色素P450 CYP716A53v2突变体，其特征在于，所述的细胞色素P450 CYP716A53v2突变体包括选自下组的蛋白：对应于野生型细胞色素P450 CYP716A53v2，(1)第117位突变为Ser、第451位突变为Ala；(2)第117位突变为Ser、第208位突变为Cys、第167位突变为Val、第451位突变为Ala；(3)第117位突变为Ser、第208位突变为Cys；(4)第117位突变为Ser、第208位突变为Cys、第451位突变为Ala；(5)第167位突变为Val；(6)第451位突变为A...
【专利技术属性】
技术研发人员：权利要求书二页说明书一二页序列表四页附图一页，
申请(专利权)人：中国科学院分子植物科学卓越创新中心，
类型：发明
国别省市：
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