一种检测睾酮和雄烯二酮的试剂盒制造技术

本发明专利技术提供了一种检测睾酮和雄烯二酮的试剂盒，包括封闭化的单人份睾酮分离纯化试剂条、睾酮和雄烯二酮定标曲线、睾酮和雄烯二酮低高质控和流动相；所述睾酮分离纯化试剂条包括可分离纯化睾酮的睾酮抗体偶联磁微粒、睾酮和雄烯二酮稳定同位素内标、洗涤液和洗脱液。本发明专利技术结合了免疫法和质谱法的优点，将分离纯化睾酮的所需试剂制备成封闭试剂条，有效避免试剂交叉污染带来的实验错误，样品前处理过程引入睾酮和雄烯二酮自身稳定同位素内标实时校正，有效消除系统误差，同时配备定标曲线和质控品，只需要简单的将样品加入到试剂条中，将处理好的样品取出上LC

【技术实现步骤摘要】
一种检测睾酮和雄烯二酮的试剂盒


[0001]本专利技术涉及一种试剂盒，尤其涉及一种检测睾酮和雄烯二酮的试剂盒。

技术介绍

[0002]睾酮，又称睾丸素、睾丸酮或睾甾酮，是一种雄激素，由男性的睾丸或女性的卵巢分泌，肾上腺亦分泌少量睾酮，具有维持肌肉强度及质量、维持骨质密度及强度、提神及提升体能等作用。通过测定睾酮值，根据测定的睾酮值偏高或偏低，可提示睾丸间质细胞瘤。先天性肾上腺皮质增生症、肾上腺肿瘤、多囊卵巢综合征、隐睾、睾丸炎、睾丸间质细胞瘤等疾病。
[0003]男性雄烯二酮是由睾丸及肾上腺分泌的一种类固醇激素，为雄激素的组成成分。雄烯二酮的生理作用为维持男性性腺特征，促进性器官发育。女性雄烯二酮由肾上腺皮质及卵巢少量分泌，维持性腺正常功能。血清雄烯二酮检测可以辅助诊断肾上腺皮质功能，如肾上腺皮质功能减退以及女性卵巢、内分泌疾病，如多囊卵巢综合征、多毛症等。
[0004]临床检测睾酮和雄烯二酮的方法主要有免疫法、气相色谱法(GC
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MS)和液相色谱串联质谱法(LC
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MS/MS)。
[0005]免疫法自动化分别检测睾酮和雄烯二酮，检测速度快，成本低，但只能单独检测，用血量高，且由于睾酮和雄烯二酮结构非常接近，抗体特异性难以保证只识别其中之一，本专利技术经过验证发现睾酮抗体识别睾酮和雄烯二酮，因此免疫法检测值可能偏高，给临床检测带来不能克服的困难。GC
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MS特异性好，可同时检测这两种激素，但样品提取、纯化和衍生步骤非常复杂，阻碍其临床应用。LC
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MS/MS主要采用电喷雾离子源结合三重四级杆分析器质谱，检测睾酮和雄烯二酮有以下优势：特异性和准确性高、检测限可以达到pg/mL，不受特殊抗体和发光试剂的限制，方法建立简单，一次处理同时检测睾酮和雄烯二酮，每个检测指标的成本相对较低，样品用量低等特点，因而成为国内外临床检验的热点。
[0006]LC
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MS/MS方法检测前需要对血清或血浆样品中的睾酮和雄烯二酮提取，去除蛋白质、脂类和多糖及其他小分子干扰物，主要有蛋白沉淀、液液萃取、固相萃取和化学衍生法等，这些方法都需要用到甲基叔丁基醚、二氯甲烷、二乙醚或正己烷等刺鼻且有毒的有机试剂，环境污染严重，操作需要特殊防护装备。理想的样品处理方法是操作简单最好能自动化、降低基质干扰、样品纯化足够干净—仅保留目标检测物、延长色谱柱及其液相和质谱使用寿命，目前尚缺乏这样的操作方法。固相萃取可以降低样品的复杂程度使样品更干净，但是由于其成本高昂、难以自动化、批处理不均一等特点限制其应用。此外质谱法检测中，需要等待样品处理后才能上质谱检测，而样品处理通常需要花费很长时间，在消耗检测人员的精力同时且极容易出错导致误诊，极大增加了检测时间，患者和检测人员均体验较差，极容易造成医患矛盾。

技术实现思路

[0007]为了解决现有游离睾酮和总睾酮浓度的检测方法复杂，免疫法检测睾酮存在抗体
特异性的缺陷，本专利技术提供了一种检测睾酮和雄烯二酮的试剂盒，本专利技术的试剂盒基于免疫法和质谱法的结合，处理后的样品仅包含目标物睾酮和雄烯二酮及其内标，样品足够干净，有效克服基质效应、极大延长色谱柱和LC
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MS/MS使用寿命，简单高效，易于临床检测和应用。
[0008]为了实现上述目的，本专利技术采用以下技术方案：
[0009]一种检测睾酮和雄烯二酮的试剂盒，所述试剂盒包括封闭化的单人份睾酮分离纯化试剂条、睾酮和雄烯二酮定标曲线、睾酮和雄烯二酮低高质控和流动相；所述睾酮分离纯化试剂条包括可分离纯化睾酮的睾酮抗体偶联磁微粒、睾酮和雄烯二酮稳定同位素内标、洗涤液和洗脱液。
[0010]在本专利技术中，本专利技术的睾酮和雄烯二酮检测试剂盒，包括封闭化的单人份睾酮分离纯化试剂条、睾酮和雄烯二酮定标曲线、睾酮和雄烯二酮低高质控和流动相。试剂条主要成分由可分离纯化睾酮的睾酮抗体偶联磁微粒、睾酮和雄烯二酮稳定同位素内标、淋洗液PBS和80％甲醇组成。通过一系列的性能验证实验，证明了使用该试剂盒能够自动化、准确检测睾酮和雄烯二酮浓度，且可以稳定存储6个月。
[0011]作为本专利技术的一种优选方案，所述睾酮抗体偶联磁微粒的制备方法包括以下步骤：
[0012]1)睾酮抗体多次离心，超滤，保存在PBS缓冲液中；
[0013]2)将磁微粒混合均匀；
[0014]3)将步骤2)的磁微粒加入去离子水，混合均匀后磁性分离去除上清液，重复多次；
[0015]4)使用PBS缓冲液重悬步骤3)得到的磁微粒，磁性分离去除上清液，重复多次；
[0016]5)使用PBS缓冲液重悬步骤4)得到的磁微粒，加入步骤1)的睾酮抗体，室温下混合；加入碳化二亚胺溶液，补足体系体积，在室温下涡旋偶联，磁性分离去除上清液；
[0017]6)使用淬灭缓冲液重悬步骤5)得到的抗体偶联磁微粒，磁性分离去除上清液，重复多次；
[0018]7)重悬步骤6)得到的抗体偶联磁微粒，以去除内源性睾酮和类固醇激素；
[0019]8)使用由高到底梯度浓度的一元醇或乙腈水溶液，恢复步骤7)得到的抗体偶联磁微粒的活性，并保存在体积分数为1
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20％一元醇或乙腈溶液中。
[0020]作为本专利技术的一种优选方案，步骤8)的梯度浓度依次为：80
‑
100％一元醇或乙腈、60
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79％一元醇或乙腈、50
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59％一元醇或乙腈、40
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49％一元醇或乙腈、30
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39％一元醇或乙腈、20
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29％一元醇或乙腈以及0
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19％一元醇或乙腈溶液。
[0021]作为本专利技术的一种优选方案，所述试剂条上设置有1号至15号的孔；其中，3号孔、4号孔与5号孔用于放置洗涤液；6号孔用于放置睾酮和雄烯二酮稳定同位素内标；7号孔用于放置睾酮抗体偶联磁微粒；9号孔用于放置洗脱液。
[0022]作为本专利技术的一种优选方案，所述洗涤液为100
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400μL的PBS溶液。
[0023]作为本专利技术的一种优选方案，所述睾酮和雄烯二酮稳定同位素内标为30
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100μL体积分数2
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30％一元醇或乙腈配制的5ng/mL睾酮
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13C3与雄烯二酮
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13C3。
[0024]作为本专利技术的一种优选方案，所述洗脱液为100
‑
300μL的体积分数为70
‑
100％一元醇或乙腈溶液。
[0025]作为本专利技术的一种优选方案，所述睾酮和雄烯二酮定标曲线由2％一元醇或乙腈
溶液98％PBS
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30％一元醇或乙腈溶液70％PBS配制，浓度分别为：雄烯二酮：0.05ng/mL、0.2ng/mL、0.5ng/mL、1ng/mL、5ng/mL以及15ng/mL；睾酮：0.05ng/m本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种检测睾酮和雄烯二酮的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括封闭化的单人份睾酮分离纯化试剂条、睾酮和雄烯二酮定标曲线、睾酮和雄烯二酮低高质控和流动相；所述睾酮分离纯化试剂条包括可分离纯化睾酮的睾酮抗体偶联磁微粒、睾酮和雄烯二酮稳定同位素内标、洗涤液和洗脱液。2.根据权利要求1所述的一种检测睾酮和雄烯二酮的试剂盒，其特征在于，所述睾酮抗体偶联磁微粒的制备方法包括以下步骤：1)睾酮抗体多次离心，超滤，保存在PBS缓冲液中；2)将磁微粒混合均匀；3)将步骤2)的磁微粒加入去离子水，混合均匀后磁性分离去除上清液，重复多次；4)使用PBS缓冲液重悬步骤3)得到的磁微粒，磁性分离去除上清液，重复多次；5)使用PBS缓冲液重悬步骤4)得到的磁微粒，加入步骤1)的睾酮抗体，室温下混合；加入碳化二亚胺溶液，补足体系体积，在室温下涡旋偶联，磁性分离去除上清液；6)使用淬灭缓冲液重悬步骤5)得到的抗体偶联磁微粒，磁性分离去除上清液，重复多次；7)重悬步骤6)得到的抗体偶联磁微粒，以去除内源性睾酮和类固醇激素；8)使用由高到低梯度浓度的一元醇或乙腈溶液，恢复步骤7)得到的抗体偶联磁微粒的活性，并保存在1
‑
20％一元醇或乙腈溶液中。3.根据权利要求2所述的一种检测睾酮和雄烯二酮的试剂盒，其特征在于，步骤8)的由高到低梯度浓度依次为：80
‑
100％一元醇或乙腈、60
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79％一元醇或乙腈、50
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59一元醇或乙腈、40
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49％一元醇或乙腈、30
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39％一元醇或乙腈、20
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29％一元醇或乙腈以及0
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19％一元醇或乙腈溶液。4.根据权利要求1所述的一种检测睾酮和雄烯二酮的试剂盒，其特征在于，所述试剂条上设置有1号至15号的...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴超超，薛建有，高强，杨利娜，李鸣晖，
申请(专利权)人：杭州佰辰医学检验所有限公司，
类型：发明
国别省市：