一种纤维蛋白原的制备工艺制造技术

本发明专利技术涉及一种纤维蛋白原的制备工艺，包括二步除杂工序、灭活剂结合巴氏法同步病毒灭活工序以及两步纯化工序。所述二步除杂工序提高了制品粗提物的得率；所述灭活剂结合巴氏法同步病毒灭活工序中，通过优化灭活剂配方，克服了巴氏灭活过程中高温对纤维蛋白原制品质量的影响，缩短了灭活工序时长；并且在减少灭活剂用量的同时，提高了制品安全性；所述两步纯化工艺，提升了制品质量属性。因此，本发明专利技术在综合考量纤维蛋白原制备工艺的高效性及必要性的基础上，缩短灭活工序时长，简化了提取工艺，降低了生产成本，同时提高了产率，获得的纤维蛋白原制品的纯度高于90％，凝固活力为16

【技术实现步骤摘要】
一种纤维蛋白原的制备工艺


[0001]本专利技术属于血液制品领域，具体涉及一种纤维蛋白原的制备工艺。

技术介绍

[0002]人纤维蛋白原(Fibrinogen)是人的凝血因子Ⅰ，是血浆蛋白的主要成份之一，分子量约为34万，等电点5.5，它能通过凝血酶的作用，使纤维蛋白原转化为不溶的纤维蛋白，网络血液中血球等有形成分凝成血块，达到止血的目的。人纤维蛋白原制品能迅速提高血液中纤维蛋白原的含量，用于治疗产后大出血和因大手术、外伤或内出血等引起的纤维蛋白原缺乏而造成的凝血障碍。在大出血和用红细胞浓缩物替代治疗时纤维蛋白原是第一个达到进床低水平的凝血因子。因此，已显示低的围手术期纤维蛋白原水平与增加出血时相关。通过补充纤维蛋白原增加纤维蛋白原水平显示，基本恢复正常的凝血功能。因为在临床手术中需求量巨大，一直处于供不应求状态。
[0003]目前，全球已有多个厂家的纤维蛋白原产品上市销售。由于制备工艺的不同，产品在安全性、纯度、复溶时间及外观上均存在差异，参照《中国药典》2015版对纤维蛋白原制品纯度要求仅为不低于70％，可见纤维蛋白原制品纯度问题亟待解决。为此，许多企业在原始材料选择、分离、纯化等多方面提高纯度，然而增加工艺步骤，必将导致产品收率降低，生产周期增长，使得各企业纤维蛋白原收率良莠不齐。因此，对现有纤维蛋白原制备工艺进行优化，在保障产品的质量特性的同时，提高制品的整体收率，是该产品研制的重点。
[0004]目前已有的制备工艺，首先，在提取原料上存在差异，制备人纤维蛋白原料主要有三种：一、冷沉淀，也是凝血因子
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制备的主要原料；二、冷胶与组分I共沉淀，其杂质较多；三、组分I沉淀。根据实际生产需求而言，为提高血浆的综合利用率，选用富含纤维蛋白原的组分Ⅰ沉淀，既保障了凝血因子
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的正常生产，又在连续生产过程中降低了凝血酶的含量，为后续纤维蛋白原纯度作出贡献。
[0005]其次，病毒灭活方法的不同。按照法规要求病毒灭活至少需要两个步骤，目前比较成熟的病毒灭活和去除方法有巴氏灭活法、S/D法、纳米膜过滤法和干热灭活。S/D法被广泛用于凝血因子类产品灭活，该法使用0.3％磷酸三丁酯和1％吐温80溶剂破坏脂包膜病毒结构，对非脂包膜病毒无效，并且高剂量S/D灭火剂的使用容易出现S/D灭火剂残留问题，例如中国专利CN102212129B公布的《柱层析法从组分Ⅰ中提取人纤维蛋白原的方法》中在SD灭活步骤中添加质量分数高达11％灭活剂，其灭活剂使用剂量较大，有机溶剂和去污剂的残留对产品的纯度及患者用药安全性均存在影响。纳米膜过滤法去除病毒效果取决于膜孔的大小，价格昂贵。法国LFB公司在S/D法和纳米膜过滤技术上，增加干热灭活法(80℃/72h)进行病毒灭活和去除，使得制品安全性提升，但多步病毒去除对收率造成影响，并且高温灭活容易导致制品活性被破坏，并且中国专利CN200910237204.6公布的《人纤维蛋白原的生产方法》中指出干热灭活法的选择对产品的外观、复溶有显著影响。相比之下，巴氏灭活法作为经典灭活脂包膜和非脂包膜的方法，工艺操作简单，但是由于凝血因子类产品对热的不稳定性，使用巴氏灭活法容易导致凝血因子类产品失效，因此一般不用于凝血因子类产品的
病毒灭活。
[0006]最后，分离纯化的步骤主要包括经典乙醇和甘氨酸沉淀法，或是离子交换树脂和Al(OH)3凝胶的吸附等。其中中国专利CN102212129B公布的《柱层析法从组分Ⅰ中提取人纤维蛋白原的方法》中层析柱需预先平衡，在层析后需要3倍柱床体积的缓冲液洗涤合并，明显增长工艺时长及设备成本；而凝胶吸附中凝胶的寿命对层析效果具有显著影响，同时会增加工艺风险。
[0007]因此，目前国内的人纤维蛋白原生产工艺存在成本高、生产周期长、产率低等问题。为此，需要从人纤维蛋白原生产工艺的源头开始在各个环节包括原液的配方乃至最后的冻干工序均需采取针对性的措施。
[0008]本专利技术提供了一种纤维蛋白原的制备工艺，包括二步除杂工序、灭活剂结合巴氏法同步病毒灭活工序以及两步纯化工序。所述二步除杂工序提高了制品粗提物的得率；在灭活剂结合巴氏法同步病毒灭活工序中，通过优化灭活剂配方，克服了巴氏灭活温度对纤维蛋白原制品质量的影响，缩短了灭活工序时长；并且在减少灭活剂用量的同时，提高了制品安全性；所述两步纯化工艺，提升了制品质量属性。因此，本专利技术在综合考量纤维蛋白原制备工艺的高效性及必要性的基础上，缩短灭活工序时长，简化了提取工艺，降低了生产成本，同时提高了产率，获得的纤维蛋白原制品的纯度高于90％，凝固活力为16-20s，复溶时间低于12min，收率高达2461瓶/吨血浆。

技术实现思路

[0009]本专利技术的目的在于提供一种纤维蛋白原的制备工艺，所述制备工艺包括以下步骤：
[0010](1)第一次除杂：将组分Ⅰ沉淀切碎，用溶解液A溶解，离心过滤，收集离心过滤液；所述溶解液A为0.44％二水枸橼酸钠溶液，pH为6.8～7.2；
[0011](2)巴氏联合灭活剂灭活：在步骤(1)所述离心过滤液中加入灭活剂，60℃恒温灭活4h后，降温至25℃以下得到灭活制品液，所述灭活剂由终浓度为0.1％的磷酸三丁酯，0.35％吐温80和10％甘氨酸组成；
[0012](3)第二步除杂：控制步骤(2)所得灭活制品液温度为2～8℃，离心收集沉淀A；
[0013](4)第一步纯化：将步骤(3)所得沉淀A切碎，用溶解液B溶解，加入-15℃以下的95％乙醇至终浓度为8％v/v，反应，离心，收集沉淀B；所述溶解液B由0.85％NaCl，1.5％二水枸橼酸钠组成，pH为6.8～7.2；
[0014](5)第二步纯化：用溶解液C溶解沉淀B，控制温度为-15～-18℃，加入-15℃以下的50％乙醇至终浓度为8％v/v，反应，离心，得到纤维蛋白原沉淀；所述溶解液由1.0％NaCl，1.5％二水枸橼酸钠，4.5％盐酸精氨酸组成，pH为6.8～7.2；
[0015](6)半成品配制：用溶解液C溶解纤维蛋白原沉淀，0.45μm滤器过滤，收集滤液为原液；
[0016](7)冻干、灭活包装。
[0017]优选地，所述步骤(1)中组分Ⅰ沉淀的制备方法为：血浆离心，于离心液中加入血浆重量2.0～4.5％的A-50凝胶，搅拌吸附，静置，分离，收集流穿液，于流穿液中加入0～15℃，0.9％氯化钠溶液，调pH为7.15～7.35，在0℃以下，加入-15℃以下的95％乙醇至终浓度为
8％v/v，控制温度为-2.5～-1.5℃，搅拌，离心得组分Ⅰ沉淀。
[0018]优选地，所述步骤(1)中，所述溶解液A溶解过程需搅拌1～1.5h，所述离心出液温度为15～20℃。
[0019]优选地，步骤(4)中所述溶解液B溶解过程需搅拌1～2h；所述95％乙醇的温度为-15～-20℃，加入速度为0.5L/min；所述离心温度为2～8℃，离心出液速度为1000～1500ml/min。
[0020]优选地，步骤(5)中所述50％本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种纤维蛋白原的制备工艺，其特征在于，所述制备工艺包括以下步骤：(1)第一次除杂：将组分Ⅰ沉淀切碎，用溶解液A溶解，离心过滤，收集离心过滤液；所述溶解液A为0.44％二水枸橼酸钠溶液，pH为6.8～7.2；(2)巴氏联合灭活剂灭活：在步骤(1)所述离心过滤液中加入灭活剂，60℃恒温灭活4h后降温至25℃以下得到灭活制品液，所述灭活剂由0.1％的磷酸三丁酯，0.35％吐温80和5～15％甘氨酸组成；(3)第二步除杂：控制步骤(2)所得灭活制品液温度为2～8℃，离心收集沉淀A；(4)第一步纯化：将步骤(3)所得沉淀A切碎，用溶解液B溶解，加入-15℃以下的95％乙醇至终浓度为8％v/v，反应，离心，收集沉淀B；所述溶解液B由0.85％氯化钠，1.5％二水枸橼酸钠组成，pH为6.8～7.2；(5)第二步纯化：用溶解液C溶解沉淀B，控制温度为-15～-18℃，加入-15℃以下的50％乙醇至终浓度为8％v/v，反应，离心，得到纤维蛋白原沉淀；所述溶解液C由1.0％氯化钠，1.5％二水枸橼酸钠，4.2～4.7％盐酸精氨酸组成，pH为6.8～7.2；(6)半成品配制：用溶解液C溶解纤维蛋白原沉淀，0.45μm滤器过滤，收集滤液为原液；(7)冻干、灭活包装。2.如权利要求1所述的纤维蛋白原的制备工艺，其特征在于，所述步骤(1)中组分Ⅰ沉淀的制备方法为：血浆离心，于离心液中加入血浆重量2.0～4.5％的A-50凝胶，搅拌吸附，静置，分离，收集流穿液，于流穿液中加入0～15℃，0.9％氯化钠溶液，调pH为7.15～7.35，在0℃以下，加入-15℃以下的95％乙醇至终浓度为8％v/v，控制温度为-2.5～-1.5℃，搅拌，离心得组分Ⅰ...

【专利技术属性】
技术研发人员：吕献忠，苏峰，崔婷婷，孙书秒，王雅琴，陈远洋，
申请(专利权)人：新疆德源生物工程有限公司，
类型：发明
国别省市：