一种人纤维蛋白原的纯化方法技术

本发明专利技术公开了一种人纤维蛋白原的纯化方法，属于血浆制品制备工艺领域。所述方法包括以下步骤：将经病毒灭活后的纤维蛋白原进行离子交换层析，得到纯化后的纤维蛋白原；所述离子交换层析采用的缓冲液包括平衡缓冲液，洗涤缓冲液和洗脱缓冲液。实验结果表明，利用本发明专利技术的纯化方法，不仅能够明显提高所得产品中人纤维蛋白原含量和纯度，还能明显降低产品中的病毒灭活剂残留。本发明专利技术的方法操作简便，成本低廉，具有良好的工业应用前景。具有良好的工业应用前景。具有良好的工业应用前景。

【技术实现步骤摘要】
一种人纤维蛋白原的纯化方法


[0001]本专利技术属于血浆制品制备工艺领域，特别涉及一种人纤维蛋白原的纯化方法。

技术介绍

[0002]人纤维蛋白原(Fibrinogen，Fg)，也称人凝血因子Ⅰ，主要由肝脏实质细胞合成，是血浆蛋白的主要成分之一，血浆中纤原含量丰富，正常人血浆中约为2～4g/L，是凝血系统中的“中心”蛋白质之一。
[0003]人纤维蛋白原是凝血过程中凝血因子相继激活的最终底物，具有止血功能，它除了直接参与凝血过程后期阶段外，还能介导血小板聚集、影响血液黏度。在凝血共同途径中，凝血酶先裂解纤维蛋白原两条Aα链氨基端Arg16
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Gly17释放出一对纤维蛋白肽A，形成纤维蛋白单体I；在裂解纤维蛋白原两条Bβ链氨基端Arg14
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Gly15释放出一对纤维蛋白肽B，形成纤维蛋白单体II，暴露纤维蛋白单体的聚合部位，通过非共价结合，形成了不稳定的可溶性纤维蛋白单体。在活化的凝血因子XIII及Ca
2+
的作用下，纤维蛋白单体互相交联，生成稳定的可溶性纤维蛋白，并将血液的有形成分包绕其中，形成牢固的血栓。除参与凝血外，人纤维蛋白原还具有其他多种功能，如与血小板膜糖蛋白IIb/IIIa结合而介导血小板聚集反应，参与动脉粥样硬化及肿瘤血行转移等。因此，制备高纯度的人纤维蛋白原在临床上具有重要价值。
[0004]目前采用较多的人纤维蛋白原纯化方法为层析纯化。申请号为201711104891.5的中国专利申请公开了一种人纤维蛋白原的制备方法，包括如下步骤：(1)将人血浆低温乙醇沉淀组分I溶解于提取液中，得到组分I溶液；(2)对步骤(1)得到的组分I溶液进行S/D灭活；(3)将赖氨酸亲和层析介质用平衡液平衡，然后对步骤(2)得到的溶液进行柱层析，收集穿透峰；(4)将阳离子交换层析介质用平衡液平衡，然后对步骤(3)得到的穿透峰进行柱层析，层析结束后用淋洗液淋洗层析柱，最后用洗脱液洗脱，收集洗脱峰，得到人纤维蛋白原溶液。但是，该方法纯化步骤较复杂，需要先后经过赖氨酸亲和柱层析和阳离子交换柱层析；而且，该方法的病毒灭活工艺采用S/D法，但是经该方法纯化后的人纤维蛋白原中还有病毒灭活剂磷酸三丁酯残留。研究发现，磷酸三丁酯对小鼠的半数致死量(LD
50
)为602mg/kg，对人体有害(The use of tri(n
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butyl)phosphate detergent mixtures to inactivate hepatitis viruses and human immunodeficiency virus in plasma and plasma's subsequent fractionation.Transfusion.1990 Sep；30(7):591
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8.)。因此，需要开发操作更简单、病毒灭活剂磷酸三丁酯残留量更少的纤维蛋白原纯化方法。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的在于提供一种纤维蛋白原的纯化方法，以简化纯化步骤，提高纤维蛋白原纯度，降低病毒灭活剂残留量。
[0006]本专利技术提供了一种纯化纤维蛋白原的方法，所述方法包括以下步骤：将经病毒灭活后的纤维蛋白原进行离子交换层析，得到纯化后的纤维蛋白原；
[0007]所述离子交换层析采用的缓冲液包括平衡缓冲液，洗涤缓冲液和洗脱缓冲液；所述平衡缓冲液为2～8mM的Tris缓冲液；所述洗涤缓冲液由NaCl和Tris的水溶液组成，其中NaCl的浓度为20～60mM，Tris的浓度为2～8mM；所述洗脱缓冲液由NaCl和Tris的水溶液组成，其中NaCl的浓度为70～130mM，Tris的浓度为2～8mM。
[0008]进一步地，所述方法包括以下步骤：用平衡缓冲液平衡层析填料，将经病毒灭活后的纤维蛋白原上柱，先用洗涤缓冲液淋洗，再用洗脱缓冲液洗脱，收集洗脱液，得到纯化后的纤维蛋白原。
[0009]进一步地，所述平衡缓冲液的pH为8.0～9.0，所述洗涤缓冲液的pH为8.0～9.0，所述洗脱缓冲液的pH为8.0～9.0。
[0010]进一步地，所述平衡缓冲液为5mM的Tris缓冲液，所述平衡缓冲液的pH为8.5；
[0011]和/或，所述洗涤缓冲液中，NaCl的浓度为30mM，Tris的浓度为5mM，所述洗涤缓冲液的pH为8.5；
[0012]和/或，所述洗脱缓冲液中，NaCl的浓度为100mM，Tris的浓度为5mM，所述洗脱缓冲液的pH为8.5。
[0013]进一步地，所述层析填料为阴离子交换层析填料，所述阴离子交换层析填料优选为聚甲基丙烯酸酯类阴离子交换树脂。
[0014]进一步地，所述聚甲基丙烯酸酯类阴离子交换树脂选自Capto Q、Fractogel EMD TMAE(M)或Fractogel EMD DEAE(M)，优选为Fractogel EMD DEAE(M)。
[0015]进一步地，所述经病毒灭活后的纤维蛋白原是按照以下方法制得的：
[0016](a)取冷沉淀，加水相溶剂溶解得到冷沉淀溶解液；
[0017](b)将冷沉淀溶解液经氢氧化铝吸附，离心，取上清，过滤，保留滤液；
[0018](c)在滤液中加入聚山梨酯80和磷酸三丁酯，灭活，得到经病毒灭活后的纤维蛋白原。
[0019]进一步地，步骤(a)中，所述冷沉淀是新鲜冰冻血浆制备的冷沉淀；所述水相溶剂为Tris缓冲液；
[0020]和/或，步骤(b)中，所述氢氧化铝的用量为冷沉淀的1wt.％～5wt.％，所述吸附的时间为10～20分钟，所述吸附的温度为20～35℃；
[0021]和/或，步骤(c)中，所述聚山梨酯80的用量为滤液的0.5wt.％～2.0wt.％，所述磷酸三丁酯的用量为滤液的0.1wt.％～0.5wt.％，所述灭活的时间为4～8小时，所述灭活的温度为24～26℃。
[0022]进一步地，步骤(a)中，所述水相溶剂为10～30mM、pH为6.0～7.5的Tris缓冲液，优选为20mM、pH为6.8的Tris缓冲液；
[0023]和/或，步骤(b)中，所述氢氧化铝的用量为冷沉淀的2wt.％，所述吸附的时间为15分钟，所述吸附的温度为25℃；
[0024]步骤(c)中，所述聚山梨酯80和磷酸三丁酯的质量比为10：3，所述聚山梨酯80的用量为滤液的1wt.％，所述灭活的时间为6小时，所述灭活的温度为25℃。
[0025]本专利技术还提供了上述方法制得的纯化后的纤维蛋白原。
[0026]进一步地，所述纤维蛋白原为人纤维蛋白原。
[0027]关于本专利技术的使用术语的定义：除非另有说明，本文中术语提供的初始定义适用
于整篇说明书的该术语；对于本文没有具体定义的术语，应该根据公开内容和上下文，给出本领域技术人员能够给予它们的含义。
[0028]S/D法是一种病毒灭活方法，是指用有机溶剂/去污剂混合物(S/D)破坏包膜病毒本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种纯化纤维蛋白原的方法，其特征在于：所述方法包括以下步骤：将经病毒灭活后的纤维蛋白原进行离子交换层析，得到纯化后的纤维蛋白原；所述离子交换层析采用的缓冲液包括平衡缓冲液，洗涤缓冲液和洗脱缓冲液；所述平衡缓冲液为2～8mM的Tris缓冲液；所述洗涤缓冲液由NaCl和Tris的水溶液组成，其中NaCl的浓度为20～60mM，Tris的浓度为2～8mM；所述洗脱缓冲液由NaCl和Tris的水溶液组成，其中NaCl的浓度为70～130mM，Tris的浓度为2～8mM。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述方法包括以下步骤：用平衡缓冲液平衡层析填料，将经病毒灭活后的纤维蛋白原上柱，先用洗涤缓冲液淋洗，再用洗脱缓冲液洗脱，收集洗脱液，得到纯化后的纤维蛋白原。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述平衡缓冲液的pH为8.0～9.0，所述洗涤缓冲液的pH为8.0～9.0，所述洗脱缓冲液的pH为8.0～9.0。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述平衡缓冲液为5mM的Tris缓冲液，所述平衡缓冲液的pH为8.5；和/或，所述洗涤缓冲液中，NaCl的浓度为30mM，Tris的浓度为5mM，所述洗涤缓冲液的pH为8.5；和/或，所述洗脱缓冲液中，NaCl的浓度为100mM，Tris的浓度为5mM，所述洗脱缓冲液的pH为8.5。5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述层析填料为阴离子交换层析填料，所述阴离子交换层析填料优选为聚甲基丙烯酸酯类阴离子交换树脂。6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述聚甲基丙烯酸酯类阴离子交换树脂选自Capto Q、Fractogel...

【专利技术属性】
技术研发人员：鲁涛，牟蕾，李伟，余伟，王黔川，
申请(专利权)人：成都蓉生药业有限责任公司，
类型：发明
国别省市：