一种同时制备人纤维蛋白原、凝血因子制造技术

本发明专利技术涉及一种同时制备人纤维蛋白原、凝血因子

【技术实现步骤摘要】
一种同时制备人纤维蛋白原、凝血因子
Ⅷ
和纤溶酶原的方法


[0001]本专利技术涉及生物制药
，特别涉及一种同时制备人纤维蛋白原、凝血因子
Ⅷ
和纤溶酶原的方法。

技术介绍

[0002]人纤维蛋白原适用于先天性纤维蛋白原减少或缺乏症、严重肝脏损伤、肝硬化、弥散性血管内凝血、产后大出血以及大手术、外伤、内出血等引起的纤维蛋白原缺乏而造成的凝血障碍，是临床上用于大出血、止血的必备急救药品。目前仅有华兰生物、博雅生物、上海莱士等少数几个血液制品企业具有人纤维蛋白原生产批件，产量不足，人纤维蛋白原属于国内紧缺药品。人凝血因子
Ⅷ
主要用于防治甲型血友病和获得性凝血因子
Ⅷ
缺乏而致的出血症状及这类病人的手术后出血。
[0003]CN105481976A涉及一种制备人凝血因子
Ⅷ
的离子交换层析用洗涤缓冲液及其用途，采用聚乙二醇(PEG)沉淀法是凝血因子
Ⅷ
的主要分离方法之一，该工艺方法的副产物PEG沉淀富含人纤维蛋白原，但是相对于组分I沉淀和冷沉淀而言，其纤维蛋白原纯度低，凝固活力差，稳定性差等，在凝血因子
Ⅷ
工艺中视为工艺废料而废弃，宝贵的血浆资源未得到充分利用。人纤溶酶原药物是治疗血纤溶酶原缺乏症的孤儿药。PEG沉淀中同样含有纤溶酶原，但是因为其浓度低，提取难度大而被废弃。CN105315360A公开了一种同时制备人凝血因子
Ⅷ
和人纤维蛋白原的方法，但是该工艺未涉及PEG沉淀的再利用问题，且其原料中的纤溶酶原未被有效提取纯化。CN107827974B公开了一种同时制备人纤维蛋白原和人纤溶酶原的方法，其主要缺点是原料中的人凝血因子
Ⅷ
未被有效提取纯化，且价格昂贵的亲和层析步骤是制备人纤维蛋白原和纤溶酶原的共有步骤，根据市场需求当仅需制备人纤维蛋白原或纤溶酶原时，亲和层析步骤的存在会导致制造成本升高。
[0004]目前已有的技术方案中，都着眼于一种或两种制品的分离提取和纯化，其他成分都作为杂蛋白被去除，很难再得到利用。由于技术的局限性，还没有任何一种技术方案可以同时从血浆中制备人纤维蛋白原、凝血因子
Ⅷ
和纤溶酶原。

技术实现思路

[0005]有鉴于此，本专利技术旨在提出一种同时制备人纤维蛋白原、凝血因子
Ⅷ
和纤溶酶原的方法，以最大程度的利用宝贵的血浆资源，通过对制备方法的改进和工艺参数的调整，可以从血浆中同时获得多种有用的制品，减少资源的浪费。
[0006]为达到上述目的，本专利技术的技术方案是这样实现的：
[0007]一种同时制备人纤维蛋白原、凝血因子
Ⅷ
和纤溶酶原的方法，从血浆中分离凝血因子
Ⅷ
的同时，以副产物PEG沉淀为原料，同时制备人纤维蛋白原和纤溶酶原；所述制备方法具体包括：
[0008]S1.血浆混合后离心分离冷沉淀；
[0009]S2.将所述冷沉淀用氨丁三醇洗涤后虹吸，废弃上清；
[0010]S3.将步骤S2得到的沉淀溶解，加入PEG，离心后分别收集上清液和PEG沉淀，其中凝血因子
Ⅷ
存在于所述上清液中，人纤维蛋白原和纤溶酶原形成所述PEG沉淀析出。
[0011]进一步的，将步骤S2得到的沉淀溶解，加入分子量为2000～5000的PEG。
[0012]进一步的，所述凝血因子
Ⅷ
的制备方法包括如下步骤：
[0013]S311.将所述步骤S3得到的上清液加入聚山梨酯80和磷酸三丁酯，24℃～26℃孵育至少6h进行S/D灭活；
[0014]S312.将步骤S311得到的灭活后制品调制后，经阴离子交换介质层析(平衡液平衡、淋洗液淋洗、洗脱液洗脱)，收集的洗脱液经超滤透析后，除菌过滤即为原液；原液经稀释、配制、分装、冻干、干热灭活得到凝血因子
Ⅷ
成品。
[0015]进一步的，人纤维蛋白原和纤溶酶原的制备方法包括如下步骤：
[0016]S321.将所述步骤S3得到的PEG沉淀溶解后，离心、过滤，加入聚山梨酯80和磷酸三丁酯，24℃～26℃孵育至少6h进行S/D灭活；
[0017]S322.将灭活后的制品通过超滤透析或者沉淀再溶解的方式使制品中氨丁三醇浓度达到0.01～0.1mol/L，pH值到达8.50～9.50，电导率达到0.1～2ms/cm；
[0018]S323.将步骤S322得到的制品澄清过滤后，使用阴离子凝胶进行层析纯化；上样前依次用0.5mol/L氢氧化钠溶液、注射用水、平衡液处理层析介质；层析上样线性速度为80～120cm/h，载量不高于100g蛋白/L凝胶；上样结束后用淋洗液顶洗凝胶2～6柱体积，流穿液和顶洗出的缓冲液废弃处理，用洗脱液进行洗脱获得洗脱制品Ⅰ；
[0019]S324.用分子量为100KD的聚醚砜超滤膜包超滤浓缩步骤S323的洗脱制品Ⅰ，3～5倍透析液等体积超滤透析，除菌过滤后即为原液，原液经稀释、配制、分装、冻干、干热灭活得到人纤维蛋白原成品；
[0020]S325.步骤S323洗脱液洗脱结束后，用0.3mol/L氯化钠溶液洗脱并收集洗脱制品Ⅱ，即为纤溶酶原初提品。该初提品中纤溶酶原含量比S321步骤所述PEG沉淀溶解后制品提高了15～25倍。
[0021]进一步的，所述步骤S325中，纤溶酶原初提品经ECH
‑
lysine sepharose 4 fast flow凝胶亲和层析后，分别用0.05mol/L磷酸盐、0.1mol/L氯化钠、0.05～0.5mol/L盐酸赖氨酸溶液洗脱；用分子量为30KD的聚醚砜超滤膜包超滤浓缩得到的洗脱制品，3～5倍透析液等体积超滤透析，除菌过滤后即为原液；原液经稀释、配制、分装、冻干、干热灭活得到人纤溶酶原成品。
[0022]进一步的，所述步骤S2中，洗涤时氨丁三醇浓度为0.01～0.1mol/L，pH6.50～7.50，洗涤温度为0～4℃。
[0023]进一步的，所述步骤S3中采用氨丁三醇进行溶解，氨丁三醇浓度为0.01～0.1mol/L，pH6.50～7.50，溶解温度为25～35℃，溶解倍数为3～5倍。
[0024]进一步的，所述步骤S3中加入PEG3350，使PEG3350浓度到达3.5％
±
0.5％，并调整pH至6.00～7.00。
[0025]进一步的，所述步骤S312中，灭活后制品调制方法为调整所述灭活后制品的氯化钠浓度至0.10～0.20mol/L；阴离子交换层析介质为Toyo Pearl DEAE
‑
650M。
[0026]进一步的，所述步骤S312中，平衡液组分为0.01～0.1mol/L的氨丁三醇，0.10～0.20mol/L的氯化钠，pH值为6.50～7.50；淋洗液组分为0.01～0.1mol/L的氨丁三醇，0.10
～0.20mol/L的本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种同时制备人纤维蛋白原、凝血因子
Ⅷ
和纤溶酶原的方法，其特征在于，从血浆中分离凝血因子
Ⅷ
的同时，以副产物PEG沉淀为原料，同时制备人纤维蛋白原和纤溶酶原；所述制备方法具体包括：S1.血浆混合后离心分离冷沉淀；S2.将所述冷沉淀用氨丁三醇溶液洗涤后虹吸，废弃上清；S3.将步骤S2得到的沉淀溶解，加入PEG，离心后分别收集上清液和PEG沉淀，其中凝血因子
Ⅷ
存在于所述上清液中，人纤维蛋白原和纤溶酶原形成所述PEG沉淀析出。2.根据权利要求1所述的一种同时制备人纤维蛋白原、凝血因子
Ⅷ
和纤溶酶原的方法，其特征在于，所述凝血因子
Ⅷ
的制备方法包括如下步骤：S311.将所述步骤S3得到的上清液加入聚山梨酯80和磷酸三丁酯，24℃～26℃孵育至少6h进行S/D灭活；S312.将步骤S311得到的灭活后制品调制后，经阴离子交换介质层析(平衡液平衡、淋洗液淋洗、洗脱液洗脱)，收集的洗脱液经超滤透析后，除菌过滤即为原液；原液经稀释、配制、分装、冻干、干热灭活得到凝血因子
Ⅷ
成品。3.根据权利要求1所述的一种同时制备人纤维蛋白原、凝血因子
Ⅷ
和纤溶酶原的方法，其特征在于，人纤维蛋白原和纤溶酶原的制备方法包括如下步骤：S321.将所述步骤S3得到的PEG沉淀溶解后，离心、过滤，加入聚山梨酯80和磷酸三丁酯，24℃～26℃孵育至少6h进行S/D灭活；S322.将灭活后的制品通过超滤透析或者沉淀再溶解的方式使制品中氨丁三醇浓度达到0.01～0.1mol/L，pH值到达8.50～9.50，电导率达到0.1～2ms/cm；S323.将步骤S322得到的制品澄清过滤后，使用阴离子凝胶进行层析纯化；上样前依次用0.5mol/L氢氧化钠溶液、注射用水、平衡液处理层析介质；层析上样线性速度为80～120cm/h，载量不高于100g蛋白/L凝胶；上样结束后用淋洗液顶洗凝胶2～6柱体积，流穿液和顶洗出的缓冲液废弃处理，用洗脱液进行洗脱获得洗脱制品Ⅰ；S324.用分子量为100KD的聚醚砜超滤膜包超滤浓缩步骤S323的洗脱制品Ⅰ，3～5倍透析液等体积超滤透析，除菌过滤后即为原液，原液经稀释、配制、分装、冻干、干热灭活得到人纤维蛋白原成品；S325.步骤S323洗脱液洗脱结束后，用0.3mol/L氯化钠溶液洗脱并收集洗脱制品Ⅱ，即为纤溶酶原初提品。4.根据权利要求3所述的一种同时制备人纤维蛋白原、凝血因子
Ⅷ
和纤溶酶原的方法，其特征在于，所述步骤S325中，纤溶酶原初提品经ECH
‑
lysine sepharose 4fast flow凝胶亲和层析后，分别用0.05mol/L磷酸盐、0.1mol/L氯化钠、0...

【专利技术属性】
技术研发人员：马小伟，谢来峰，张学成，李光飞，杨保平，薛继初，
申请(专利权)人：华兰生物工程股份有限公司，
类型：发明
国别省市：