本发明专利技术属于血液制品领域，具体涉及一种Rho(D)人免疫球蛋白生产工艺。本发明专利技术通过采用低温乙醇蛋白分离法和柱层析法，分离纯化蛋白，并采用S/D灭活病毒和纳米膜过滤除病毒两种灭活/去除工艺，同时灭活脂包膜和非脂包膜病毒，降低了经血液制品传播疾病的风险，且利用本发明专利技术所得Rho(D)人免疫球蛋白制品的纯度高达99.7％，收率最高达3320瓶/吨血浆，其收率较传统低温乙醇分离法可提高8％
【技术实现步骤摘要】
一种Rho(D)人免球蛋白的生产工艺
[0001]本专利技术属于血液制品领域，具体涉及一种Rho(D)人免疫球蛋白生产工艺。
技术介绍
[0002]新生儿溶血病见于胎儿和新生儿期，是因血型不合引起的，主要临床表现为黄疸、水肿、 贫血和肝脾肿大，发症包括充血性心力衰竭、胆红素脑病以及神经功能障碍等，严重者将引 起造成胎儿/新生儿的死亡。在我国，随着二胎政策的放开，母婴Rh血型不合引起的新生儿 溶血病越来越受到人们的关注，而治疗和预防该类疾病的Rho(D)人免疫球蛋白在国内尚未上 市，也不允许进口，因此市面上存在“一剂难求”的现象。
[0003]Rho(D)人免疫球蛋白是一种含有抗
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D抗体的免疫球蛋白制剂，主要用于预防和治疗因 Rh血型不合引起的新生儿溶血病，在妊娠28周及产后72小时内各注射一剂Rho(D)人免疫 球蛋白，RhD致敏率将降低至0.001％。Rho(D)人免疫球蛋白上市将填补国内空白。
[0004]首先，对于血液制品来说病毒灭活是保证制品安全的关键步骤，单一的病毒灭活存在不 能达到同时灭活脂包性和非脂包性病毒的目的，因此血液制品一般需进行两步以上的病毒灭 活工艺，以提高制品病毒灭活/去除的效果，降低经血液制品传播疾病的风险。其次，提高纯 度和产率也是血液制品分离制备的关键，目前，有大量的血液制品分离制备的工艺研究，包 括低温乙醇分离法、层析法、两步病毒去除/灭活的运用，但是产品的纯度、产率和质量得不 到保证。因此，建立一种既能高效灭活病毒，又能提高Rho(D)人免疫球蛋白收率和纯度的生 产工艺较为重要。
[0005]本专利技术通过采用低温乙醇蛋白分离法和柱层析法，分离纯化蛋白，并采用S/D灭活病毒 和纳米膜过滤除病毒两种灭活/去除工艺，同时灭活脂包膜和非脂包膜病毒，降低了经血液制 品传播疾病的风险，且利用本专利技术所得产品收率较传统低温乙醇分离法可提高8％
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12％。
技术实现思路
[0006]本专利技术的目的在于提供一种Rho(D)人免球蛋白生产工艺，所述生产工艺包括以下步骤：
[0007](1)制备组分I：用0.9％氯化钠溶液稀释血浆至蛋白含量为45～55g/L，调血浆pH为 7.1～7.3，0℃以下加入
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15℃以下的95％乙醇，使乙醇终浓度为8％v/v，控制终温度
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3.0℃～
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2.0℃ 搅拌反应，离心得组分I上清液；
[0008](2)制备组分II+III(组分I+II+III)：调步骤(1)所得组分I上清液pH为6.80～7.00， 加入
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15℃以下的95％乙醇，使乙醇终浓度为21％v/v，控制终温度
‑
6.0℃～
‑
4.0℃搅拌得反应液， 将反应液分离获得组分II+III沉淀；
[0009](3)制备组分I+III(组分III)：用氯化钠溶液溶解步骤(2)所述的组分I+II+IIII沉 淀，调溶液pH为5.00～5.20，0℃以下，加入
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15℃以下的95％乙醇，使乙醇终浓度为16％v/v， 控制终温度
‑
6.0℃～
‑
4.0℃搅拌反应，将反应液分离获得组分I+III滤液；
[0010](4)S/D灭活：调节步骤(3)所得组分I+III滤液pH为5.25～5.35，4～8℃下加入1％ 的聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X
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100)和0.3％的磷酸三丁酯(TNBP)，搅拌后静置，获得 S/D灭活液；
[0011](5)第一次超滤：步骤(4)所述S/D灭活液pH为3.8～4.0，用0.45μm滤芯过滤后使用 30kDa超滤膜包进行浓缩至蛋白含量为30～50g/L时，用2～8℃透析水连续等体积透析脱醇至 蛋白含量＞6％，得超滤液；
[0012](6)层析：调步骤(5)所述透析液电导为1.8～2.2ms/cm，pH为6.50～6.70，蛋白液浓 度≥35g/L，上离子交换层析柱，收集层析液；
[0013](7)第二次超滤：调节步骤(6)所述流出液pH为3.8～4.2，用2～8℃透析水连续等体 积透析至蛋白含量≥55g/L，得超滤液；
[0014](8)灭活病毒：低pH孵放灭活病毒，得灭活液；
[0015](9)纳米膜过滤除病毒：用过滤孔径20nm的纳米膜进行除病毒过滤；
[0016](10)第三次超滤：将步骤(8)得到的灭活液，用0.85％氯化钠溶液进行透析至并将蛋 白含量浓缩至抗
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D抗体效价＞1000IU/mL进行透析至，得蛋白原液；
[0017](11)成品：加入麦芽糖和甘氨酸，配置半成品，调pH值为6.4～7.4，0.45μm滤芯除菌 灌装制得成品。
[0018]优选地，步骤(2)中所述反应液分离前，需在反应液中加入硅藻土，所述加入硅藻土的 量为15g/kg。
[0019]优选地，步骤(3)中所述氯化钠溶液的浓度为0.01mol/L。
[0020]优选地，步骤(3)中所述分离为压滤分离，所述压滤压力为0.05～0.25MPa，所述出液 温度为
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5.5℃～
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3.5℃。
[0021]优选地，步骤(6)中所述浓缩液上离子交换层析柱前，需先平衡层析柱，所述平衡过程 为：先用醋酸盐缓冲液处理层析柱，再用磷酸盐平衡缓冲液平衡层析柱。
[0022]优选地，所述离子层析柱为DEAE Sepharose Fast Flow离子交换层析柱，所述上样速度 ≤3L/min。
[0023]优选地，步骤(8)中所述低pH孵放灭活步骤为：调pH为3.9～4.3，在23～25℃条件下， 孵放至少21天。
[0024]优选地，步骤(10)中所述除病毒过滤过程中的前端过滤压力≤0.3MPa。
[0025]优选地，步骤(11)所述半成品中抗
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D抗体效价为1000IU/ml，蛋白含量为140g/L，麦 芽糖含量为30g/L，甘氨酸含量为25g/L，pH值为6.4～7.4。
[0026]本专利技术的有益效果是：
[0027]①
本专利技术采用低温乙醇分离法和层析法分离纯化蛋白，运用不同浓度乙醇进行多次沉淀， 提高目的蛋白获得量，结合DEAE Sepharose Fast Flow离子交换层析去除杂蛋白，所得产品 收率较传统低温乙醇分离法可提高8％
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12％，所得制剂纯度高达99.7％，收率高达3320瓶/ 吨血浆(Rho(D)人免疫球蛋白的规格为：1500IU(1.5ml/瓶))。
[0028]②
采用S/D灭活病毒、巴氏灭活病毒、纳米膜除病毒灭活工艺，确保了病毒灭活/去除的 有效性。
具体实施方式
[0029]为使本专利技术实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体 实施方式，进一步阐述本专利技术。但本专利技术的保本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种Rho(D)人免球蛋白生产工艺，其特征在于，所述生产工艺包括以下步骤：(1)制备组分I：用0.9％氯化钠溶液稀释血浆至蛋白含量为45～55g/L，调血浆pH为7.1～7.3，0℃以下加入
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15℃以下的95％乙醇，使乙醇终浓度为8％v/v，控制终温度
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3.0℃～
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2.0℃搅拌反应，离心得组分I上清液；(2)制备组分II+III：调步骤(1)所得组分I上清液pH为6.80～7.0，加入
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15℃以下的95％乙醇，使乙醇终浓度为21％v/v，控制终温度
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6.0℃～
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4.0℃搅拌得反应液，将反应液分离获得组分I+II+III沉淀；(3)制备组分I+III：用氯化钠溶液溶解步骤(2)所述的组分I+II+III沉淀，调溶液pH为5.00～5.20，0℃以下，加入
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15℃以下的95％乙醇，使乙醇终浓度为16％v/v，控制终温度
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6.0℃～
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4.0℃搅拌反应，将反应液压滤分离获得组分I+III滤液；(4)S/D灭活：调节步骤(3)所得组分I+III滤液pH为5.25～5.35，4～8℃下加入1％的Triton X
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100和0.3％的磷酸三丁酯(TNBP)，搅拌后静置，分离获得S/D灭活液；(5)第一次超滤：步骤(4)所述S/D灭活液pH为3.8～4.0，用0.45μm滤芯过滤后使用30kDa超滤膜包进行浓缩至蛋白含量为30～50g/L时，用2～8℃透析水连续等体积透析脱醇至蛋白含量＞60g/L，得蛋白超滤液；(6)层析：调节步骤(5)所述透析液电导为1.8～2.2ms/cm，pH为6.50～6.70，蛋白液浓度≥35g/L，上离子交换层析柱，收集层析液；(7)第二次超滤：调节步骤(6)所述流出液pH为3.8～4.2，用2...
【专利技术属性】
技术研发人员：吕献忠，苏峰，王雅琴，孙书秒，陈远洋，崔婷婷，
申请(专利权)人：新疆德源生物工程有限公司，
类型：发明
国别省市：
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