一种马铃薯金线虫RPA-LFD快速检测方法及应用技术

本发明专利技术公开了一种马铃薯金线虫RPA

【技术实现步骤摘要】
一种马铃薯金线虫RPA
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LFD快速检测方法及应用


[0001]本专利技术涉及生物
，特别是涉及一种马铃薯金线虫RPA
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LFD快速检测方法及应用。

技术介绍

[0002]马铃薯金线虫(Globodera rostochiensis)和马铃薯白线虫(Globodera pallida)统称马铃薯孢囊线虫(Potato cyst nematode，简称PCN)，是一类对马铃薯具有高度专化性和经济重要性的有害生物。PCN作为单一病原侵染危害马铃薯，可造成其减产30％。该线虫是马铃薯生产上重要的检疫性有害生物。PCN繁殖力高，且在不良环境条件下可以存活很久，因此一旦种群建立后很难彻底根除。目前马铃薯金线虫在我国局部地区发生，为我国的内、外检重要的检疫性有害生物。PCN形态学特征非常相似，难以区分，传统的马铃薯胞囊线虫鉴定方法必须借助于一定数量特征性的孢囊或雌虫，并结合2龄幼虫特征进行鉴别，因此马铃薯孢囊线虫检测的专业性特别强，同时还需要有足够数量的标本。为了保护我国农业生产的安全，防止马铃薯白线虫传入我国及马铃薯金线虫在我国的传播扩散，开展马铃薯孢囊线虫的特异快速的分子检测技术研究具有重要的现实意义。
[0003]马铃薯孢囊线虫的分子鉴定的研究始于上世纪80年代，研究人员利用蛋白电泳技术，基于马铃薯白线虫和马铃薯金线虫的蛋白差异，开发设计了多条特异性探针，可以用来检测并区分两种PCN。利用血清学技术，Schots等筛选获得了PCN的两个种的特异性的单克隆抗体，可以对其进行定量鉴定。以分类为目的的核酸检测技术始于1985年，但当时的核酸检测方法耗时较长、需要大量的核酸且不灵敏。随着PCR技术的不断优化，反应灵敏度和效率不断提高，促使仅利用少量的材料即可实现检测。PCR方法更适合用来研究线虫DNA。通过设计了PCR引物，对PCN两个种进行扩增，检测PCR的产物可以很好地区分两种马铃薯孢囊线虫。以PCR技术为基础，基于DNA分子多态性发展而来的各种分子标记技术在PCN的检测鉴定应用中均有涉及，如RAPD、AFLP、RFLP、实时荧光PCR和一些恒温扩增的技术LAMP在检测PCN中也有应用。
[0004]重组酶聚合酶扩增技术(RPA)2006年由英国Olaf Piepenburg组首次提出，并且该技术已用于检测多种病原物，如Subbotin(2018)利用RPA扩增了象耳豆根结线虫IGS rRNA片段序列，并用实时荧光检测其扩增产物，灵敏度为1/10的二龄幼虫。鞠玉亮(2019)建立了南方根结线虫、爪哇根结线虫、花生根结线虫和象耳豆根结线虫的RPA快速检测方法。迟元凯(2020)建立了爪哇根结线虫RPA
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LFD检测方法，37
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42℃恒温条件下20min内即可实现阳性样品的可视化检测结果。但在马铃薯金线虫上尚无相关报道。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的是提供一种马铃薯金线虫RPA
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LFD快速检测方法及应用，以解决上述现有技术存在的问题，通过设计RPA特异性引物和LFD特异性探针，建立了马铃薯金线虫的RPA
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LFD快速检测方法，能够高灵敏度、特异性的快速检测马铃薯金线虫。
[0006]为实现上述目的，本专利技术提供了如下方案：
[0007]本专利技术提供一种马铃薯金线虫RPA
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LFD快速检测引物和探针，所述引物序列为如SEQ ID NO:1所示上游引物序列和SEQ ID NO:2所示下游引物序列，所述探针序列如SEQ ID NO:3所示。
[0008]优选的是，所述下游引物的5＇末端添加Biotin。
[0009]优选的是，所述探针的5＇末端添加Fam，5'末端和3'末端的中间加入一个四氢呋喃，3'末端添加Spacer
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C3亚磷酰胺。
[0010]本专利技术还提供一种马铃薯金线虫RPA
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LFD快速检测试剂盒，包括所述的引物和探针。
[0011]优选的是，还包括试纸条，所述试纸条为链霉亲和素和Fam抗体修饰金纳米标记的核酸检测试纸条。
[0012]优选的是，还包括DNA提取试剂，所述DNA提取试剂包括裂解液A和裂解液B。
[0013]本专利技术还提供一种马铃薯金线虫RPA
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LFD快速检测方法，利用所述的引物和探针进行RPA反应，将RPA反应的最终产物点到LF试纸条上，静置观察结果，根据观察的结果判断是否为马铃薯金线虫。
[0014]优选的是，RPA反应体系包括：
[0015]1)反应混合液：再水化液25μL，上游引物和下游引物各2.1μL，探针0.6μL，醋酸镁2.5μL，上述所有的溶液溶解于酶干粉中，加灭菌双蒸馏水补充到48μL；
[0016]2)2μL DNA模板。
[0017]优选的是，RPA反应条件为：将所述反应混合液和DNA模板混合均匀后，37～40℃温育30min。
[0018]本专利技术还提了所述的引物和探针，或者所述的试剂盒，或者所述的方法的应用，应用于如下(a)
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(c)任一项：
[0019](a)检测进出口植物产品中携带马铃薯金线虫的情况；
[0020](b)检测土壤中马铃薯金线虫发生情况；
[0021](c)鉴定马铃薯金线虫。
[0022]本专利技术公开了以下技术效果：
[0023]本专利技术设计1条RPA正向引物，1条biotin修饰的反向引物和一条修饰Fam的探针，在聚合酶和重组酶的作用下，产生带有biotin和Fam的扩增产物，从而被链霉亲和素和Fam抗体修饰金纳米标记的核酸检测试纸条所检测。利用上述设计的特异性引物对和探针检测马铃薯金线虫具有如下的优点：
[0024](一)检测特异性强：RPA所用的引物和探针均只为马铃薯金线虫模板DNA发生扩增反应，具有双重特异性的保证，比其他检测方法更具保真性。
[0025](二)检测时间短：从线虫核酸提取到RPA
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LFD检测仅需时45min，一步法提取一步法检测，前期后期均无需任何其他程序。
[0026](三)检测条件要求低：RPA不需要PCR仪等任何升温仪器，在37～40℃即可达到反应温度，检测无需凝胶电泳和成像系统，试纸条即可完成检测。
[0027](四)检测步骤少、操作简单、结果明显，整个检测过程不涉及复杂仪器和设备，一般人员即可完成检测，结果容易辨别，肉眼即可观察结果，不需要繁琐的电泳和紫外观察。
[0028](五)对人和环境友好，检测过程不需要使用EB等有毒试剂，对人和环境非常安全。
[0029]综上所述，本专利技术相比现有检测马铃薯金线虫的方法具有更高的特异性、灵敏度和便携性，可以在实际生产中现场应用检测。该技术可应用于对携带有马铃薯金线虫进出口物品包括土壤样品及植物上快速分子检测，具有重要的实际应用价值。
附图说明
[0030]为了更清楚地说明本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种马铃薯金线虫RPA
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LFD快速检测引物和探针，其特征在于，所述引物序列为如SEQ ID NO:1所示上游引物序列和SEQ ID NO:2所示下游引物序列，所述探针序列如SEQ ID NO:3所示。2.如权利要求1所述的引物和探针，其特征在于，所述下游引物的5＇末端添加Biotin。3.如权利要求1所述的引物和探针，其特征在于，所述探针的5＇末端添加Fam，5'末端和3'末端的中间加入一个四氢呋喃，3'末端添加Spacer
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C3亚磷酰胺。4.一种马铃薯金线虫RPA
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LFD快速检测试剂盒，其特征在于，包括权利要求1
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3任一项所述的引物和探针。5.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，还包括试纸条，所述试纸条为链霉亲和素和Fam抗体修饰金纳米标记的核酸检测试纸条。6.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，还包括DNA提取试剂，所述DNA提取试剂包括裂解液A和裂解液B...

【专利技术属性】
技术研发人员：王旭，彭德良，葛建军，彭焕，雷荣，
申请(专利权)人：中国检验检疫科学研究院，
类型：发明
国别省市：