一种针对胃泌素17的双模态免疫层析试剂盒及其检测方法技术

本发明专利技术公开了一种针对胃泌素17的双模态免疫层析试剂盒及其检测方法，包括检测试纸和磁性纳米酶探针，涉及免疫层析检测领域，试纸包括上样垫、结合垫、层析垫、吸收垫，所述组成部分依次相互重叠粘贴在底板上，通过在层析垫上平行喷洒胃泌素17捕获抗体、羊抗鼠免疫球蛋白G抗体设置检测T线和控制C线，T线和C线间隔3～7mm，本发明专利技术可以达到较低的检测下限，满足胃泌素17测试的灵敏度需求，实现层析芯片反应区域磁性号的定量检测，避免生物样本的背景信号干扰。干扰。干扰。

【技术实现步骤摘要】
一种针对胃泌素17的双模态免疫层析试剂盒及其检测方法


[0001]本专利技术涉及免疫层析检测领域，尤其涉及一种针对胃泌素17的基于纳米酶信号增强以及磁性免疫层析芯片的定量检测方法。

技术介绍

[0002]胃泌素是一种重要的胃肠激素，它由胃窦部G细胞分泌，主要调节胃酸分泌和胃黏膜的生长及功能，当胃窦发生萎缩时，胃泌素17(G
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17)水平会下降。在临床诊断中，测量G
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17的水平可评估胃分泌功能，以指示胃粘膜萎缩的风险、萎缩的位置和程度。
[0003]目前检测血清G
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17的方法有放射免疫法和酶联免疫吸附法(ELISA)，其缺点在于需要专业的实验室和人员。免疫层析是一种快速、低成本的检测方法，不需要专业的人员，一般可在1小时内读取测试结果，已成为一种典型的即时检测方法。然而，由于人血清中G
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17的含量较低，正常范围为25～90pg/mL，所以免疫层析方式很难实现G
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17的检测。
[0004]国内仅有少量的相关专利(CN201710852552.9、CN201520916570.5、CN201810746656.6、CN201610944101.3)且均采用荧光微球作为探针，荧光探针一般需要激发光激发之后才能发出荧光信号，常见的荧光探针有荧光染料、纳米量子点和上转换纳米粒子。常规的光学检测方法仅能检测出捕获区域表面光学信号，而磁信号检测可以检测出层析芯片测试区域更深处的磁信号，因此处于反应区的磁性粒子，不论在硝酸纤维素膜(NC膜)上的深度位置如何，产生的磁信号均可以被探测到，同时，由于被分析物(如血液，尿液)的磁性背景信号很低，所以背景信号影响很小。
[0005]目前，用于磁性探针的免疫层析检测仪器在国内市场上比较少见，磁性探针的信号既可以借助它很强的着色能力用裸眼或者相机读取，同时可以通过配套磁免分析仪实现检测目标定量检测。
[0006]纳米酶增强免疫层析信号是近年来的研究新热点。2007年，磁性氧化铁纳米粒子(Fe3O4)被发现具有过氧化氢酶的催化作用。此后的研究表明，多种金属和金属氧化物纳米粒子(例如氧化铁，二氧化铈和金纳米粒子)，碳纳米材料(包括碳纳米管和氧化石墨烯)以及多种金属有机骨架(MOF)通过模仿天然酶的结构或功能而具有出色的催化活性。与蛋白酶相比，纳米酶具有更高的催化稳定性和较低的制造成本，并且更易于在其表面修饰基团。纳米酶不仅具有纳米材料的特性，可作为蛋白酶的替代品，而且提供了与复杂生物环境相接的多模态平台。纳米酶的其中一个重要的应用就是与层析检测中的纳米探针相结合。基于纳米酶的层析检测有两种信号读出模式，一个是纳米酶探针的本身颜色产生的比色信号，另一个是通过催化供氢底物被过氧化氢氧化生成的颜色信号，两种信号读出模式相结合，可以得到更高的精度和更宽的检测范围。目前已有很多研究将纳米酶应用于层析检测中。磁性氧化铁是第一种被开发并被应用于层析检测信号放大的纳米酶材料。除了氧化铁之外，一系列其他纳米酶也被应用于放大层析信号，如铂纳米粒子，磁性普鲁士蓝纳米酶等。
[0007]因此，本领域的技术人员致力于开发一种基于纳米酶信号增强以及磁性免疫层析
芯片的针对胃泌素17定量检测方法。

技术实现思路

[0008]有鉴于现有技术的上述缺陷，有必要提供一种针对胃泌素17且具有高检测灵敏度的检测方法。
[0009]为了达到上述目的，本专利技术公开了一种针对胃泌素17的双模态免疫层析试剂盒及检测方法，采用以下技术方案予以实现：
[0010]本专利技术的第一个方面，公开了一种针对胃泌素17的双模态免疫层析试剂盒，其特征在于，包括检测试纸和磁性纳米酶探针，所述试纸包括上样垫、结合垫、层析垫、吸收垫，所述组成部分依次相互重叠2mm粘贴在底板上，所述层析垫上平行设置检测T线和控制C线，所述T线和C线是通过喷洒胃泌素17捕获抗体和羊抗鼠免疫球蛋白G抗体形成，所述T线和C线间隔3～7mm。
[0011]本专利技术的第二个方面，公开了一种针对胃泌素17的双模态免疫层析检测方法，包括以下步骤：
[0012]步骤1、制备免疫磁性纳米酶探针；
[0013]将Fe3O4@Pt与胃泌素17的捕获抗体混合，使抗体结合在探针表面，置于4℃备用；
[0014]步骤2、制备免疫层析试纸条；
[0015]用缓冲液预处理样品垫和层析垫，将样品垫、结合垫、层析垫和吸收垫依次叠加2毫米粘贴在底板上，用包被稀释液将胃泌素17捕获抗体、羊抗鼠免疫球蛋白G抗体平行喷洒在层析垫上，作为T线和C线；
[0016]步骤3、层析检测和纳米酶颜色信号增强；
[0017]将待测溶液、空白溶液、不同浓度标准溶液、所述步骤1制备的磁性纳米酶探针滴在结合垫上，层析结束后，将供氢底物与30％H2O2混合后，滴加在T和C线上，观察比色信号；
[0018]步骤4、磁信号的采集和标曲绘制；
[0019]用裸眼观察后，将步骤3层析结束后的试纸插入磁性免疫分析仪进行磁信号检测，获得T线和C线的峰值，计算T/C比值，记录不同浓度标准样品检测的磁信号T/C与实际浓度之间的对应关系，绘制标准曲线。
[0020]进一步地，步骤1具体包括：
[0021]步骤1.1、将1mg Fe3O4@Pt在超声下分散5分钟，然后与100ug捕获抗体混合，获得磁性纳米酶探针；
[0022]步骤1.2、将所述探针超声分散，洗涤后加入封闭液，在摇床振荡下封闭2小时；
[0023]步骤1.3、将步骤1.2获得的探针洗涤2次后，重新分散在200uL缓冲液中，置于4℃备用。
[0024]优选地，所述Fe3O4@Pt的粒径为10～500nm。
[0025]优选地，步骤1.2中超声分散1.5小时，采用间歇式超声混匀法，超声功率约250W，超声10秒，间歇5秒。
[0026]优选地，步骤2中使用包被稀释液将所述胃泌素17捕获抗体、羊抗鼠免疫球蛋白G抗体的浓度调整到1～5mg/mL，膜液量1～2uL/cm，平行喷洒在结合垫上作为T线和C线。
[0027]进一步地，步骤3所述层析检测具体包括：
[0028]步骤3.1、将待测溶液、空白溶液、不同浓度标准溶液分别与所述步骤1制备的磁性纳米酶探针混合并预孵育；
[0029]步骤3.2、用外部磁铁富集探针，提取上清液移至样品垫上，富集的探针重新分散并滴在结合垫上；
[0030]步骤3.3、10分钟后，加入工作缓冲液清洗背景残留物质，所有工作缓冲液被吸收垫吸收后，完成层析过程；
[0031]优选地，所述供氢底物选自DAB试剂、TMB试剂、TMBS试剂或者OPD试剂。
[0032]进一步优选地，所述供氢底物选为DAB试剂。
[0033]进一步优选地，所述DAB试剂与30％H2O2混合比例为10：3。
[0034]与现有技术相比，本专利技术具有以下有益效果：
[0035]1、相对于荧光法只本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种针对胃泌素17的双模态免疫层析试剂盒，其特征在于，包括检测试纸和磁性纳米酶探针，所述试纸包括上样垫、结合垫、层析垫、吸收垫，组成部分依次相互重叠2mm粘贴在底板上，层析垫上平行设置检测T线和控制C线，T线和C线间隔3～7mm，是通过分别喷洒胃泌素17捕获抗体、羊抗鼠免疫球蛋白G抗体形成。2.一种针对胃泌素17的双模态免疫层析检测方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：步骤1、制备免疫磁性纳米酶探针；将磁性纳米酶探针与胃泌素17的捕获抗体混合，使抗体结合在探针表面，置于4℃备用；步骤2、制备免疫层析试纸条；用缓冲液预处理样品垫和层析垫，将样品垫、结合垫、层析垫和吸收垫依次叠加2mm粘贴在底板上，用包被稀释液将胃泌素17捕获抗体和羊抗鼠免疫球蛋白G抗体平行喷洒在层析垫上，作为T线和C线；步骤3、层析检测和纳米酶颜色信号增强；将待测溶液、空白溶液、不同浓度标准溶液和所述步骤1制备的磁性纳米酶探针预处理后滴在结合垫上，层析结束后，将供氢底物与30％H2O2混合后，滴加在T和C线上，观察比色信号；步骤4、磁信号的采集和标曲绘制；用裸眼观察后，将步骤3层析结束后的试纸插入磁性免疫分析仪进行磁信号检测，获得T线和C线的峰值，计算T/C比值，记录不同浓度标准样品检测的磁信号T/C与实际浓度之间的对应关系，绘制标准曲线。3.如权利要求2所述的针对胃泌素17的双模态免疫层析检测方法，其特征在于，步骤1具体包括：步骤1.1、将1mg Fe3O4@Pt在超声下分散5分钟，然后与100ug捕获抗体混合，获得磁性纳米酶探针；步骤1.2、将所述探针超声分散，洗涤后加入封闭液，在摇床振荡下封闭2小时；步骤1.3...

【专利技术属性】
技术研发人员：王侃，郑楚君，徐昊，
申请(专利权)人：上海交通大学，
类型：发明
国别省市：