本申请公开了一种恒温扩增的测序方法。将修饰了两种扩增引物的微球首先固载到基因测序芯片上，然后在芯片内进行恒温扩增反应，从而应用于基因测序。本发明专利技术所述的方法效率比较高，不需要特殊的仪器，不需要复杂的建库流程，并且可以和现有的测序方法兼容，特别的也适合于荧光切换的测序方法。于荧光切换的测序方法。于荧光切换的测序方法。
【技术实现步骤摘要】
一种芯片上恒温扩增测序的方法
[0001]本专利技术涉及一种芯片上恒温扩增测序的方法，属于基因测序领域。
技术介绍
[0002]高通量测序技术是目前生命科学领域常见的分析技术之一，该技术可以将DNA样本片段进行测序，得到对应样本的DNA序列，建立生物表型与基因组、转录组等层面上的联系。现在，第二代测序技术因为其巨大的通量和相对廉价的价格，已经占据了测序领域的绝大部分市场。第二代测序技术的一大特点就是不是对单独的一条DNA进行测序，而是将一条DNA进行扩增几千几万倍后再进行测序和信号采集，而这其中就要用到不同的DNA扩增技术。目前当今世界上的主流测序技术都有着自己对应的特有的扩增技术。Illumina公司可逆末端终止测序技术使用了桥式扩增方法：在平面芯片表面种植两种不同引物后进行桥式PCR并得到DNA簇；Ion torrent公司的半导体测序方法对应的是乳液PCR的扩增方法：在形成的乳液内的微球上进行固相PCR，之后再固载到芯片上；华大测序仪则是使用的DNA纳米球的扩增方式：将DNA固载到芯片表面后扩增成一团DNA纳米球。但是这些方法要么直接与现有的荧光发生测序方法不兼容，要么需要特殊且复杂的文库构建过程，要么需要额外的复杂仪器单独进行扩增。
[0003]本专利技术阐述了一种基于固载了两种引物微球的、在芯片上发生的恒温扩增方法。将预先修饰好的微球通过固载基团固载到芯片上，然后通入试剂，经过杂交，恒温扩增的步骤就可以进行测序反应。本专利技术提供一种高通量基因测序反应的恒温扩增的微球准备方法，不需要复杂的仪器、特殊的设备，并且和已知的大部分测序反应可以兼容，特别的可以应用于荧光发生或者称为荧光切换的测序反应。
技术实现思路
[0004]本专利技术的目的在于针对现有技术存在的不足，提供一种芯片上恒温扩增测序的方法，在将微球固载到芯片上，原位的发生杂交、扩增反应，并且应用于测序的方法。
[0005]为实现上述目的，本专利技术采取下述方案：
[0006]一种芯片上恒温扩增测序的方法，其特征在于，包括以下步骤，
[0007](1)将微球固载到基因测序芯片的表面
[0008]所述的微球表面预先连接了两种恒温扩增引物，即第一扩增引物和第二扩增引物，并且至少一种扩增引物的序列上含有剪切位点；
[0009]所述微球的表面还预先修饰了固载用的基团,利用固载基团将微球固载到基因测序芯片的表面；
[0010](2)杂交，延伸，解旋，清洗
[0011]将扩增模板杂交到微球上，所述的扩增模板两端含有公共的接头序列，即接头序列1和接头序列2，所述接头序列1和第一扩增引物，至少部分序列是互补配对的，扩增模板的接头序列1与微球上的第一扩增引物杂交；
[0012]加入含有DNA聚合酶的反应液，扩增引物在聚合酶的作用下延伸，形成与扩增模板互补配对的DNA链；所述含有DNA聚合酶的反应液中含有dNTP；
[0013]解旋，并且清洗解旋下的扩增模板片段，得到微球表面带有与扩增模板互补配对的DNA链；
[0014](3)恒温扩增
[0015]加入恒温扩增试剂，在重组酶存在的条件下，进行微球表面扩增，生成固定在芯片上的多个双链模板DNA；
[0016]加入剪切试剂，通过作用于含有剪切位点的扩增引物，选择性去除扩增后的双链模板DNA中的第二链；
[0017]加入封端试剂，将微球表面的DNA链或扩增引物的3
’
端进行封堵；
[0018](4)测序
[0019]杂交测序引物，对芯片上的第一链进行测序。
[0020]根据优选的实施方式，其中所述微球上修饰有两种扩增引物，并且连接有固载用基团；扩增模板的两端含有公共的接头序列，接头序列1和第一扩增引物，至少部分序列是互补配对的；接头序列2和第二扩增引物至少部分序列是相同的。
[0021]根据优选的实施方式，所述剪切位点允许酶促剪切、化学剪切或光化学剪切。
[0022]本专利技术还提供一种芯片上恒温扩增测序的方法，其特征在于，包括以下步骤，
[0023](1)将微球固载到基因测序芯片的表面
[0024]所述的微球表面预先连接了两种恒温扩增引物，即第一扩增引物和第二扩增引物；
[0025]所述微球的表面还预先修饰了固载用的基团；
[0026](2)杂交，延伸
[0027]将扩增模板杂交到微球上，所述的扩增模板两端含有公共的接头序列，即接头序列1和接头序列2，所述接头序列1和第一扩增引物，至少部分序列是互补配对的，扩增模板的接头序列1与微球上的第一扩增引物杂交；
[0028]加入含有DNA聚合酶的反应液，扩增引物在聚合酶的作用下延伸，形成与扩增模板互补配对的DNA链；所述含有DNA聚合酶的反应液中含有dNTP；
[0029](3)恒温扩增
[0030]加入恒温扩增试剂，在重组酶存在的条件下，进行微球表面扩增；
[0031](4)测序
[0032]杂交测序引物，测序。
[0033]根据优选的实施方式，所述的微球是玻璃微球，PS微球，水凝胶微球中的一种。
[0034]根据优选的实施方式,所述基因测序芯片的至少一个内表面有阵列排布的微坑。
[0035]根据优选的实施方式，所述微坑的开口尺寸为0.1
‑
5微米，优选0.2
‑
3微米，更优选0.3
‑
2微米。
[0036]根据优选的实施方式，所述的微球表面预先修饰了固载用的基团，指的是，连接了同基因测序芯片表面相匹配的、可以利用化学方法将微球和基因测序芯片连接在一起的基团。所述的固载指的是将微球连接到基因测序芯片的表面。
[0037]根据优选的实施方式，优选地，所述扩增为恒温扩增。
[0038]根据优选的实施方式，优选地，所述扩增为重组酶聚合酶扩增(RPA)、重组酶介导等温核酸扩增(RAA)、桥式扩增中的一种。
[0039]根据优选的实施方式，所述RPA扩增的时间为5
‑
90分钟。
[0040]根据优选的实施方式，其特征在于，所述扩增引物的长度为20
‑
45bp。
[0041]根据优选的实施方式，所述微球上有生物素作为固载用的基团，所述基因测序芯片上有修饰的链霉亲和素；通过生物素和链霉亲和素的特异性反应将微球连接到基因测序芯片上。
[0042]根据优选的实施方式，所述微球的直径为0.3
‑
5微米，优选0.5
‑
4微米，更优选1
‑
2微米。
[0043]本专利技术同时还提供一种基因测序方法，其特征在于，将待测的DNA分子打断成50
‑
2000bp的片段，作为扩增模板，按照前面所述的方法测序。
[0044]有益效果：
[0045]本专利技术采用一种基于固载了两种引物的微球的在芯片上发生的恒温扩增用于测序的方法。通过将带有两种引物的微球固载本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种芯片上恒温扩增测序的方法，其特征在于，包括以下步骤，(1)将微球固载到基因测序芯片的表面所述的微球表面预先连接了两种恒温扩增引物，即第一扩增引物和第二扩增引物，并且至少一种扩增引物的序列上含有剪切位点；所述微球的表面还预先修饰了固载用的基团,利用固载基团将微球固载到基因测序芯片的表面；(2)杂交，延伸，解旋，清洗将扩增模板杂交到微球上，所述的扩增模板两端含有公共的接头序列，即接头序列1和接头序列2，所述接头序列1和第一扩增引物，至少部分序列是互补配对的，扩增模板的接头序列1与微球上的第一扩增引物杂交；加入含有DNA聚合酶的反应液，扩增引物在聚合酶的作用下延伸，形成与扩增模板互补配对的DNA链；所述含有DNA聚合酶的反应液中含有dNTP；解旋，并且清洗解旋下的扩增模板片段，得到微球表面带有与扩增模板互补配对的DNA链；(3)恒温扩增加入恒温扩增试剂，在重组酶存在的条件下，进行微球表面扩增，生成固定在芯片上的多个双链模板DNA；加入剪切试剂，通过作用于含有剪切位点的扩增引物，选择性去除扩增后的双链模板DNA中的第二链；加入封端试剂，将微球表面的DNA链或扩增引物的3
’
端进行封堵；(4)测序杂交测序引物，对芯片上的第一链进行测序。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：其中所述微球上修饰有两种扩增引物，并且连接有固载用基团；扩增模板的两端含有公共的接头序列，接头序列1和第一扩增引物，至少部分序列是互补配对的；接头序列2和第二扩增引物至少部分序列是相同的。3.一种芯片上恒温扩增测序的方法，其特征在于，包括以下步骤，(1)将微球固载到基因测序芯片的表面所述的微球表面预先连接了两种恒温扩增引物，即第一扩增引物和第二扩增引物；所述微球的表面还预先修饰了固载用的基团；(2)杂交，延伸将扩增模板杂交到微球上，所述的扩增模板两端...
【专利技术属性】
技术研发人员：康力，张晓璐，乔朔，孙文婷，赵玉兰，段海峰，陈子天，
申请(专利权)人：赛纳生物科技北京有限公司，
类型：发明
国别省市：
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