一种芯片表面双端扩增测序的方法技术

本发明专利技术涉及一种芯片表面双端扩增测序的方法，在第一链测序完成后，重新向芯片表面提供扩增寡核苷酸，用于第二链的生成，通过控制提供的扩增寡核苷酸的数量，可以控制第二链的生成数量，增加第二链的测序信号，从而提高测序准确度；本发明专利技术的方法还可与其他高通量测序技术兼容，兼容性更强。兼容性更强。兼容性更强。

【技术实现步骤摘要】
一种芯片表面双端扩增测序的方法


[0001]本专利技术涉及一种芯片表面双端扩增测序的方法，属于基因测序领域。

技术介绍

[0002]现阶段高通量测序技术发展迅速，已成为目前生命研究的常用的分析方法，它具有通量高、检测速度快、灵活多用、成本低的特点，这种技术需要通过扩增将目的DNA指数性的放大，从而实现同时检测几十万到几百万的DNA分子的目的，因此一种测序技术对应一种扩增方式。目前，在高通量测序领域中较为简单的是单端测序，即只需要一种测序引物，测序时从引物5
’‑3’
的方向进行延伸测序，只能按照一种方向进行读取信号，使用的扩增也较为简单，将目的DNA通过PCR或其他扩增技术扩增一次就可以得到大量待测样品。但是单端测序的质量会随着测序的进行而下降，测序序列越往后越不准确，读长受到一定的限制。
[0003]双端测序技术是指在构建待测DNA文库时在两端的接头上都加上测序引物结合位点，在第一链测序完成后，用对读测序模块(Paired
‑
End Module)引导第二链的再生和扩增，以达到第二轮测序所用的模板量，进行第二链的测序。对同一核酸分子进行双端测序时，例如常见的Illumina的双端测序方法(参见专利CN101663405B)，固相介质表面连接两种扩增引物，每种扩增引物上含有不同的剪切位点，通过剪切此剪切位点，将扩增形成的双链DNA分别进行线性化，再进行测序；在第一链测序结束后，此时介质表面留有经过剪切后的扩增引物，再以此扩增引物进行第二链的生成反应，以用于二链的测序。这种常规的技术路线有明显的不足之处：在对第一链测序的过程中，经过数十轮甚至上百轮的测序反应循环，介质表面残留的剪切后的扩增引物不可避免地损耗、与聚合酶等蛋白非特异性结合以及由于未被成功封端而发生非特异性延伸，上述因素均使得可用于第二链生成的扩增引物大大减少，严重影响第二链的生成效率，使第二链的测序信号降低，最终使得测序的准确度降低。
[0004]为了解决上述问题，本专利技术提供了一种新的技术思路，即在第一链测序前的剪切反应，将扩增引物尽可能靠近其5
’
端彻底剪切掉，在第一链测序结束后，再重新提供新的扩增引物，用于第二链的生成，增加第二链的生成量，从而提高测序信号和测序准确度。

技术实现思路

[0005]本专利技术公开了一种芯片表面双端扩增测序的方法，其特征在于，包括：
[0006](1)提供固定在支持介质表面的至少两种扩增寡核苷酸，即至少提供第一扩增寡核苷酸以及第二扩增寡核苷酸，所述第一扩增寡核苷酸包含一种剪切位点，所述第二扩增寡核苷酸包含一种剪切位点，且两种剪切位点互不相同；所述支持介质表面修饰有化学基团；
[0007](2)提供单链模板多核苷酸，将所述单链模板多核苷酸与支持介质表面的第一扩增寡核苷酸杂交；所述的单链模板多核苷酸两端含有公共接头序列，即接头序列1和接头序列2，其中，接头序列1和第一扩增寡核苷酸至少部分序列是互补配对的；接头序列2和第二
扩增寡核苷酸至少部分序列是相同的；初始延伸所述第一扩增寡核苷酸，以生成与所述模板多核苷酸互补的延伸产物；解旋，得到介质表面带有与模板多核苷酸互补配对的多核苷酸单链；
[0008](3)扩增：提供扩增反应物，进行介质表面扩增，生成多个固定在介质表面的双链多核苷酸，所述双链多核苷酸包括第一链和第二链；
[0009](4)剪切，封端：通过作用于第一扩增寡核苷酸，在剪切位点位置打断所述第一扩增寡核苷酸，选择性去除所述双链多核苷酸中的第二链，并生成可延伸的3
’
末端；加入封端试剂，将介质表面的核酸链或寡核苷酸的3
’
端进行封堵；
[0010](5)第一链测序：杂交第一测序引物，测序；解旋；
[0011](6)向芯片表面重新提供扩增寡核苷酸，用于第二链的生成，所述扩增寡核苷酸至少包括所述第一扩增寡核苷酸或者不包含剪切位点的第一扩增寡核苷酸；
[0012](7)生成固定在介质表面的与所述第一链互补配对的第二链；
[0013](8)剪切，封端：通过作用于第二扩增寡核苷酸，在剪切位点位置打断所述第二扩增寡核苷酸，选择性去除所述双链多核苷酸中的第一链，并生成可延伸的3
’
末端；加入封端试剂，将介质表面的核酸链或寡核苷酸的3
’
端进行封堵；
[0014](9)第二链测序：杂交第二测序引物，测序。
[0015]根据优选的实施方式，所述支持介质表面具备离散分布的凹陷结构，为发生反应的微反应室，形状是圆柱形、圆台形、凹槽、类圆台形、类六方柱结构，或者其组合。
[0016]根据优选的实施方式，所述支持介质是惰性基底或基质，所述惰性基底或基质的材料包括但不限于玻璃、硅、二氧化硅、光纤或光纤束、树脂、陶瓷、金属、硝化纤维素、聚乙烯、聚苯乙烯、苯乙烯与其他材料的共聚物、聚丙烯、丙烯酸、聚丁烯、聚氨酯。
[0017]根据优选的实施方式，所述支持介质包括惰性基底或基质以及媒介材料，所述媒介材料直接附接所述扩增寡核苷酸，并通过共价作用力或非共价作用力连接至惰性基底或基质；所述媒介材料包括但不限于水凝胶层、水凝胶微球、磁性微球；所述惰性基底或基质的材料包括但不限于玻璃、硅、二氧化硅、光纤或光纤束、树脂、陶瓷、金属、硝化纤维素、聚乙烯、聚苯乙烯、苯乙烯与其他材料的共聚物、聚丙烯、丙烯酸、聚丁烯、聚氨酯。
[0018]根据优选的实施方式，支持介质表面修饰的所述化学基团包括，氨基、羧基、环氧基、羟基、醛基、叠氮基、炔基、环炔基、马来酰亚胺、琥珀酰亚胺、巯基等；所述扩增寡核苷酸通过与所述化学基团发生反应固定在支持介质表面。
[0019]根据优选的实施方式，所述剪切位点允许酶促剪切、化学剪切或光化学剪切。
[0020]根据优选的实施方式，其中所述剪切位点包括用切口内切核酸酶剪切的位点。
[0021]根据优选的实施方式，所述剪切包括使所述支持介质表面与包含至少一种酶的组合物接触以在所述剪切位点处产生无碱基位点，其中所述剪切在所述剪切位点处发生。
[0022]根据优选的实施方式，所述扩增寡核苷酸包含尿嘧啶碱基或8
‑
氧代鸟嘌呤碱基或脱氧次黄嘌呤碱基或四氢呋喃修饰的碱基。
[0023]根据优选的实施方式，其中所述至少一种在所述剪切位点处产生无碱基位点的酶包括尿嘧啶DNA糖基化酶和选自DNA糖基化酶
‑
裂合酶内切核酸酶
Ⅷ
或Fpg糖基化酶的内切核酸酶或核酸内切酶Ⅳ。
[0024]根据优选的实施方式，所述剪切位点选自尿嘧啶碱基、8
‑
氧代鸟嘌呤碱基、脱氧次
黄嘌呤碱基、四氢呋喃修饰的碱基、邻位双羟基修饰的亚磷酰胺位点、二硫基、偶氮基、叠氮基、肽键、一个或多个核糖核苷酸、缩酮、缩醛、二苯基硅氧烷、碳酸酯、氨基甲酸酯等。
[0025]根据优选的实施方式，步骤(4)和步骤(8)中所述剪切反应完成后，需要生成可延伸的3...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种芯片表面双端扩增测序的方法，其特征在于，包括：(1)提供固定在支持介质表面的至少两种扩增寡核苷酸，即至少提供第一扩增寡核苷酸以及第二扩增寡核苷酸，所述第一扩增寡核苷酸包含一种剪切位点，所述第二扩增寡核苷酸包含一种剪切位点，且两种剪切位点互不相同；所述支持介质表面修饰有化学基团；(2)提供单链模板多核苷酸，将所述单链模板多核苷酸与支持介质表面的第一扩增寡核苷酸杂交；所述的单链模板多核苷酸两端含有公共接头序列，即接头序列1和接头序列2，其中，接头序列1和第一扩增寡核苷酸至少部分序列是互补配对的；接头序列2和第二扩增寡核苷酸至少部分序列是相同的；初始延伸所述第一扩增寡核苷酸，以生成与所述模板多核苷酸互补的延伸产物；解旋，得到介质表面带有与模板多核苷酸互补配对的多核苷酸单链；(3)扩增：提供扩增反应物，进行介质表面扩增，生成多个固定在介质表面的双链多核苷酸，所述双链多核苷酸包括第一链和第二链；(4)剪切，封端：通过作用于第一扩增寡核苷酸，在剪切位点位置打断所述第一扩增寡核苷酸，选择性去除所述双链多核苷酸中的第二链，并生成可延伸的3
’
末端；加入封端试剂，将介质表面的核酸链或寡核苷酸的3
’
端进行封堵；(5)第一链测序：杂交第一测序引物，测序；解旋；(6)向芯片表面重新提供扩增寡核苷酸，用于第二链的生成，所述扩增寡核苷酸至少包括所述第一扩增寡核苷酸或者不包含剪切位点的第一扩增寡核苷酸；(7)生成固定在介质表面的与所述第一链互补配对的第二链；(8)剪切，封端：通过作用于第二扩增寡核苷酸，在剪切位点位置打断所述第二扩增寡核苷酸，选择性去除所述双链多核苷酸中的第一链，并生成可延伸的3
’
末端；加入封端试剂，将介质表面的核酸链或寡核苷酸的3
’
端进行封堵；(9)第二链测序：杂交第二测序引物，测序。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述支持介质表面具备离散分布的凹陷结构，为发生反应的微反应室，形状是圆柱形、圆台形、凹槽、类圆台形、类六方柱结构，或者其组合。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述支持介质是惰性基底或基质，所述惰性基底或基质的材料包括但不限于玻璃、硅、二氧化硅、光纤或光纤束、树脂、陶瓷、金属、硝化纤维素、聚乙烯、聚苯乙烯、苯乙烯与其他材料的共聚物、聚丙烯、丙烯酸、聚丁烯、聚氨酯。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述支持介质包括惰性基底或基质以及媒介材料，所述媒介材料直接附接所述扩增寡核苷酸，并通过共价作用力或非共价作用力连接至惰性基底或基质；所述媒介材料包括但不限于水凝胶层、水凝胶微球、磁性微球；所述惰性基底或基质的材料包括但不限于玻璃、硅、二氧化硅、光纤或光纤束、树脂、陶瓷、金属、硝化纤维素、聚乙烯、聚苯乙烯、苯乙烯与其他材料的共聚物、聚丙烯、丙烯酸、聚丁烯、聚氨酯。5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，支持介质表面修饰的所述化学基团包括，氨基、羧基、环氧基、羟基、醛基、叠氮基、炔基、环炔基、马来酰亚胺、琥珀酰亚胺、巯基等；所述扩增寡核苷酸通过与所述化学基团发生反应固定在支持介质表面。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述剪切位点允许酶促剪切、化学剪切或光化学剪切。7.根据权利要求6所述的方法，其中所述剪切位点包括用切口内切核酸酶剪切的位点。8.根据权利要求6所述的方法，其中所述剪切包括使所述支持介质表面与包含至少一种酶的组合物接触以在所述剪切位点处产生无碱基位点，其中所述剪切在所述剪切位点处发生。9.根据权利要求8所述的方法，其中所述扩增寡核苷酸包含尿嘧啶碱基或8
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氧代鸟嘌呤碱基或脱氧次黄嘌呤碱基或四氢呋喃修饰的碱基。10.根据权利要求8或9所述的方法，其中所述至少一种在所述剪切位点处产生无碱基位点的酶包括尿嘧啶DNA糖基化酶和选自DNA糖基化酶
‑
裂合酶内切核酸酶
Ⅷ
或Fpg糖基化酶的内切核酸酶或核酸内切酶Ⅳ。11.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述剪切位点选自尿嘧啶碱基、8

【专利技术属性】
技术研发人员：乔朔，辛宇，石磊，康力，王晓洁，
申请(专利权)人：赛纳生物科技北京有限公司，
类型：发明
国别省市：