一种脊肌萎缩症的致病基因检测方法技术

本发明专利技术公开了一种脊肌萎缩症的致病基因检测方法，其包括如下步骤：S1、制备探针和基因芯片：根据脊肌萎缩症以SMN1基因全基因组区域作为目标捕获区域，再根据目标捕获区域设计捕获探针，并合成基因芯片；S2、样本DNA提取：采用试剂盒提取样本基因组DNA；S3、基因组DNA酶切及修复：基因组DNA酶切片段化并进行修复；S4、产物PCR扩增与纯化；S5、杂交捕获目标捕获区域及PCR扩增；S6、上机测序：通过高通量测序平台进行上机测序；S7、信息分析：统计测序结果信息，确定突变位点发生的基因、氨基酸改变。本发明专利技术所述的脊肌萎缩症的致病基因检测方法够快速检测出脊肌萎缩症的基因突变，操作简单方便，特异性高，准确性好，简单经济。简单经济。

【技术实现步骤摘要】
一种脊肌萎缩症的致病基因检测方法


[0001]本专利技术涉及分子生物学
，更具体地，涉及一种脊肌萎缩症的致病基因检测方法。

技术介绍

[0002]脊肌萎缩症(Spinal Muscular Atrophy,SMA)是一种以脊髓前角运动神经元和脑干运动神经元核变性为特征的常染色体隐性遗传的神经肌肉病，是第二大常见致死性常染色体隐性遗传病，发病率约为1/6000-1/10000左右，在人群中的携带率约为1/35-1/50左右。大多数病例都属常染色体隐性遗传，是第5号染色体上一个单独的基因位点上的等位基因SMN突变，定位于5q12.2-13.3。SMN包括端粒端的SMN1和着丝粒端的SMN2，其中SMN1的基因缺陷是导致脊肌萎缩症的主要原因。SMN1基因全长27Kb，包含9个外显子(1，2a，2b，3～8)，该基因存在与其高度同源的SMN2基因，前者为SMA疾病的致病基因，后者则为疾病表型的修饰基因。脊肌萎缩症临床可以分为4种类型：(1)Ⅰ型脊肌萎缩症，在胎儿中已存在或在出生后2～4个月出现症状，在6个月龄期前，所有患病婴儿都已表现出明显的运动功能发育的延缓，1-4死亡的，通常由于心肌无力，死于呼吸衰竭；(2)Ⅱ型(中间型)脊肌萎缩症，患儿大多数是在6～12个月期间出现症状，在2岁以前所有病例都已有明显症状，所有患儿都显出肌张力过低，伴松弛性肌肉无力，腱反射消失与肌肉束颤；(3)Ⅲ型脊肌萎缩症，在2～30岁期间发病，病理变化及遗传方式与前两种变型相似，但病情进展较为缓慢，预期寿命也较长，腿部的无力与肌萎缩最为显著，以股四头肌与髋关节屈肌最早出现症状；(4)Ⅳ型脊肌萎缩症，遗传方式不定(常染色体隐性，常染色体显性，性联)，成年期发病(年龄30～60岁)，病情进展缓慢。
[0003]目前临床上用于SMA辅助检测主要有：限制性片段长度多态性聚合酶链式反应技术(PCR-RFLP)、多重连接探针扩增技术(MLPA)、变性高效液相色谱分析(PCR-DHPLC)、实时荧光定量PCR、等。PCR-RFLP法可用于SMN1基因7号外显子纯合缺失患者进行定性分析，但有可能存在酶切不彻底造成漏诊或误诊。MLPA法、PCR-DHPLC法可用于检测纯合缺失型患者以及杂合缺失型携带者，但操作复杂、通量低、耗时长、需特定的仪器、且价格较贵。实时荧光定量PCR会与非特异性产物结合，特异性无法保证，易导致检测误差。

技术实现思路

[0004]本专利技术旨在克服上述现有技术的至少一种缺陷，提供一种脊肌萎缩症的致病基因检测方法，所述检测方法能够快速检测出脊肌萎缩症的基因突变，操作简单方便，特异性高，准确性好，简单经济。
[0005]本专利技术采取的技术方案如下：
[0006]一种脊肌萎缩症的致病基因检测方法，包括如下步骤：
[0007]S1、制备探针和基因芯片：根据脊肌萎缩症以SMN1基因全基因组区域并向上下游延伸各30bp作为目标捕获区域，再根据目标捕获区域设计捕获探针，根据探针合成基因芯
片；
[0008]S2、样本DNA提取：采用试剂盒提取样本基因组DNA；
[0009]S3、基因组DNA酶切及修复：基因组DNA通过酶切片段化，将酶切的粘性末端修复成平末端，并通过连接3
’
端加碱基“A”；
[0010]S4、产物PCR扩增与纯化：设计PCR扩增引物，PCR扩增两端带有接头的DNA片段，扩增完成后纯化；
[0011]S5、杂交捕获目标捕获区域及PCR扩增：将步骤S1所得的基因芯片对步骤S4纯化后的产物进行杂交捕获，再对所得的产物进行PCR扩增；
[0012]S6、上机测序：通过高通量测序平台进行上机测序；
[0013]S7、信息分析：统计测序结果信息，确定突变位点发生的基因、氨基酸改变。
[0014]优选地，步骤S1的捕获探针为FAM-ACCCGGTAAGGAAAATAAAGGAAGT。
[0015]优选地，步骤S2采用的试剂盒为QIAamp基因组DNA提取试剂盒。
[0016]优选地，步骤S2通过酶切片段化剪切为200bp大小的DNA片段。
[0017]优选地，步骤S3酶切采用的是限制性内切酶Tap I。
[0018]优选地，步骤S4的扩增引物为：上游引物：SEQ ID NO:2：5
’-
ATACGCGGGTTTGCTATG-3
’
；下游引物SEQ ID NO:3:5
’-
CCTCAACACCCTTCTCACAG-3
’
。
[0019]优选地，步骤S4中产物PCR扩增的条件为：95℃预变性3min，然后进行8～10个如下循环：98℃25s，50℃30s，75℃30s，循环结束后，再75℃退火8min，得到的扩增产物4℃保存。
[0020]优选地，步骤S4中纯化过程为：用Agencourt Ampure SPRI XP bead纯化PCR扩增产物。
[0021]优选地，步骤S5中PCR扩增条件为：98℃预变型1min；变形98℃10s、退火60℃30s、延伸72℃30s，共10个循环；循环结束后延伸72℃5min，降温至4℃保存。
[0022]优选地，步骤S6中高通量测序平台为Illumina HiSeq2000测序平台。
[0023]与现有技术相比，本专利技术的有益效果为：本专利技术针对脊肌萎缩症进行了引物和探针设计，以目的基因SMN1的特异性位点作为参考设计了特异性强的引物和探针，能够快速检测出脊肌萎缩症的基因突变，操作简单方便，特异性高，准确性好，简单经济，适用于大规模临床应用。
具体实施方式
[0024]为使本专利技术的目的、技术方案和优点更加清楚，下面结合具体实施例将对本专利技术的技术方案进行详细的描述。显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所得到的所有其它实施方式，都属于本专利技术所保护的范围。
[0025]下述实施例中所用的实验原料、试剂材料等，如无特殊说明，均为普通市售产品。
[0026]研究对象：选择2019年1月至2019年12月在中山大学某附属医院就诊的确诊为脊肌萎缩症的患者20名，采集患者的外周血，对患者进行SMN1基因的检测，从外周血白细胞提取基因组DNA均经过本人同意。
[0027]实施例
[0028]一种脊肌萎缩症的致病基因检测方法，包括如下步骤：
[0029]S1、制备探针和基因芯片：根据脊肌萎缩症以SMN1基因全基因组区域并向上下游延伸各30bp作为目标捕获区域，再根据目标捕获区域设计捕获探针：FAM-ACCCGGTAAGGAAAATAAAGGAAGT，根据设计的探针合成基因芯片。
[0030]S2、样本DNA提取：DETA抗凝管采外周血5mL，采用QIAamp基因组DNA提取试剂盒提取样本基因组DNA。
[0031]S3、基因组DNA酶切及修复本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种脊肌萎缩症的致病基因检测方法，其特征在于，包括如下步骤：S1、制备探针和基因芯片：根据脊肌萎缩症以SMN1基因全基因组区域并向上下游延伸各30bp作为目标捕获区域，再根据目标捕获区域设计捕获探针，根据探针合成基因芯片；S2、样本DNA提取：采用试剂盒提取样本基因组DNA；S3、基因组DNA酶切及修复：基因组DNA通过酶切片段化，将酶切的粘性末端修复成平末端，并通过连接3
’
端加碱基“A”；S4、产物PCR扩增与纯化：设计PCR扩增引物，PCR扩增两端带有接头的DNA片段，扩增完成后纯化；S5、杂交捕获目标捕获区域及PCR扩增：将步骤S1所得的基因芯片对步骤S4纯化后的产物进行杂交捕获，再对所得的产物进行PCR扩增；S6、上机测序：通过高通量测序平台进行上机测序；S7、信息分析：统计测序结果信息，确定突变位点发生的基因、氨基酸改变。2.根据权利要求1所述的脊肌萎缩症的致病基因检测方法，其特征在于，步骤S1的捕获探针为SEQ ID NO:1：FAM-ACCCGGTAAGGAAAATAAAGGAAGT。3.根据权利要求1所述的脊肌萎缩症的致病基因检测方法，其特征在于，步骤S2采用的试剂盒为QIAamp基因组DNA提取试剂盒。4.根据权利要求1所述的脊肌萎缩症的致病基因检测方法，其特征在于，步骤S2通过酶切片段化剪切为200bp大小的DNA片段。5.根据权利要求1所述的脊肌萎缩症的致病基因检...

【专利技术属性】
技术研发人员：段志峰，
申请(专利权)人：广州源古纪科技有限公司，
类型：发明
国别省市：