测序核酸分子的方法技术

本公开提供了用于核酸序列鉴定的方法。所述方法可以包括使多个核酸分子与包含一定浓度的核苷酸的反应混合物接触，这导致核酸分子的部分标记。所述方法可包括在前一测序循环中的可逆终止子的去封闭完成之前开始下一可逆终止的测序循环。终止的测序循环。终止的测序循环。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】测序核酸分子的方法
交叉引用
[0001]本申请要求2019年5月3日提交的第62/842,534号美国临时申请和2019年10月2日提交的第62/909,389号临时申请的权益，这些申请中的每个均通过引用整体并入本文。

技术介绍

[0002]存在多种用于鉴定核酸序列的方法。此类方法通常包括使用荧光标记核苷酸，以在单个碱基掺入生长核酸链时利于鉴定单个碱基，例如通过检测荧光标记。例如，可以终止掺入生长核酸链中的碱基，防止第二核苷酸掺入链中的下一位置，破坏检测的信号。在一些情况下，核苷酸的终止可以被逆转以掺入后续的碱基。或者或另外，掺入生长核酸链中的碱基可以是非终止的，并允许第二核苷酸掺入链中的下一位置。可以在流入下一批核苷酸之前去除荧光标记，以利于后续碱基掺入的检测。可以重复流入一批标记碱基和可逆终止子和/或去除染料部分的循环任意次数以对更长的链进行测序。

技术实现思路

[0003]核苷酸可包含标记基团。核苷酸可以是非终止的。或者，可以通过修饰核苷酸以包含可以加帽3
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OH基团以暂时终止聚合酶反应的封闭基团，例如叠氮甲基或二硫化物基团来可逆地终止核苷酸。在一些情况下，封闭基团也可以是标记或用作标记(例如，荧光标记)，使得单个部分既终止又标记核苷酸。去除这种封闭基团既可以逆转核苷酸的终止，又可以从核苷酸去除标记。在其他情况下，可以独立于封闭基团去除荧光标记。
[0004]在使多个核酸分子(例如，具有序列同一性的克隆群体)与包含规范(canonical)碱基类型的核苷酸的反应混合物接触后，由于例如反应动力学和/或抑制掺入的其他因素并非被配置为掺入该规范碱基类型的核苷酸的所有可用掺入位点都可以完成核苷酸的掺入。因为聚合酶可与此类非天然核苷酸不相容，当反应混合物包括荧光标记核苷酸时，此类掺入失败事件可能更可能发生。因此，使用该规范碱基类型询问多个核酸分子将以低于100％的掺入速率结束，并且如果使包括不同规范碱基类型的核苷酸的后续反应混合物与该多个核酸接触分子，会有滞后定相(phasing)。在某些情况下，当生长链在流之前掺入核苷酸时，前导定相可能发生。当存在滞后定相时，在预期的掺入后来自滞后链的信号可能出现。当存在前导定相时，在预期的掺入之前来自前导链的信号可能出现。这种滞后定相和前导定相可最终导致测序质量下降并限制读取长度。本文认识到需要解决至少上述问题的系统和方法。
[0005]此外，荧光标记的去除通常会导致疤痕，这可损坏生长核酸链。疤痕对测序质量的累积影响可能是显著的。与基于给定序列的检测亮度变化相对应的上下文依赖问题也很常见。此外，核苷酸的去封闭反应可能相对缓慢(例如，一分钟或更长时间)，并且可能在大量链上渐近地(例如，自然对数)发生。例如，实现99.33％(例如，1
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1/(e5))的去封闭完成花费的时间可能是实现63％(例如，1
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1/e)完成花费的时间的5倍。因此，本文认识到需要至少解决上述问题的核酸序列鉴定方法，例如减轻疤痕、定相和上下文依赖的影响，以及加速测序
迭代。本公开提供用于核酸序列鉴定的方法、系统和试剂盒。本文描述的方法可以解决核酸序列鉴定，同时避免疤痕形成、定相和/或上下文依赖问题。类似地，本文描述的方法可以加速核酸序列鉴定。
[0006]一方面，本专利技术提供一种用于测序的方法，包括：(a)提供多个核酸分子，其中所述多个核酸分子彼此具有序列同一性；(b)在足以将第一多个核苷酸掺入与多个核酸分子的第一子集偶联的第一多个生长链中的条件下，使多个核酸分子与包含相同规范碱基类型的第一多个核苷酸的第一反应混合物接触；(c)在(b)之后，在足以将第二多个核苷酸掺入与多个核酸分子的第二子集偶联的第二多个生长链中的条件下，使多个核酸分子与包含相同规范碱基类型的第二多个核苷酸的第二反应混合物接触，其中第一多个核苷酸或第二多个核苷酸包含非终止核苷酸。
[0007]在一些实施方案中，在第一组反应条件下使第一反应混合物与(b)中的多个核酸分子接触，并且其中在与第一组反应条件不同的第二组反应条件下使第二反应混合物与(c)中的多个核酸分子接触。在一些实施方案中，第一组反应条件和第二组反应条件具有一个或多个不同的条件，该条件选自温度、pH值、盐浓度、镁浓度、锰浓度、锶浓度、核苷酸浓度、孵育时间、反应混合物体积、反应混合物到多个核酸分子的分配速度以及聚集或粘度试剂浓度。
[0008]在一些实施方案中，第一多个核苷酸包含标记核苷酸。在一些实施方案中，第一多个核苷酸的至少5％是标记核苷酸。在一些实施方案中，第一多个核苷酸的至少10％是标记核苷酸。在一些实施方案中，第一多个核苷酸的至少20％是标记核苷酸。在一些实施方案中，第一多个核苷酸的至少30％是标记核苷酸。
[0009]在一些实施方案中，第一多个核苷酸包含未标记核苷酸。在一些实施方案中，第一多个核苷酸包含标记核苷酸和未标记核苷酸。在一些实施方案中，第二多个核苷酸包含未标记核苷酸。在一些实施方案中，第二多个核苷酸的基本上100％是未标记核苷酸。在一些实施方案中，第二多个核苷酸包含标记核苷酸。在一些实施方案中，第二多个核苷酸包含标记核苷酸和未标记核苷酸。在一些实施方案中，第一反应混合物中核苷酸的基本上100％具有相同规范碱基类型。在一些实施方案中，第二反应混合物中核苷酸的基本上100％具有相同规范碱基类型。
[0010]在一些实施方案中，第一多个核苷酸是非终止的。在一些实施方案中，第二多个核苷酸是非终止的。在一些实施方案中，第一多个核苷酸和第二多个核苷酸是非终止的。
[0011]在一些实施方案中，将第一多个核苷酸的子集掺入第一多个生长链的生长链中，掺入生长链中对应于均聚物序列的核苷酸位置。在一些实施方案中，将第二多个核苷酸的子集掺入第二多个生长链的生长链中，掺入生长链中对应于均聚物序列的核苷酸位置。在一些实施方案中，在多个核酸分子中第一多个生长链和第二多个生长链是相互排斥的。在一些实施方案中，第一多个生长链和第二多个生长链共享至少一个共同生长链。在一些实施方案中，至少一个共同生长链的共同生长链掺入第一多个核苷酸的第一核苷酸和第二多个核苷酸的第二核苷酸。
[0012]在一些实施方案中，所述方法进一步包括使多个核酸分子与洗涤溶液接触：(i)在(b)之后且在(c)之前，(ii)在(c)之后，或(iii)(i)和(ii)两者。
[0013]在一些实施方案中，第一多个核苷酸包含标记核苷酸，并且进一步包括使多个核
酸分子与切割溶液接触以从标记核苷酸切割标记：(i)在(b)之后且在(c)之前，(ii)在(c)之后，或(iii)(i)和(ii)两者。
[0014]在一些实施方案中，所述方法进一步包括，在(c)之后，在足以将第三多个核苷酸掺入与多个核酸分子的第三子集偶联的第三多个生长链中的条件下，使多个核酸分子与包含相同规范碱基类型的第三多个核苷酸的第三反应混合物接触。在一些实施方案中，所述方法进一步包括，在第二流循环中，使用第三反应混合物代替第一反应混合物重复(b)...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种用于测序的方法，包括：(a)提供多个核酸分子，其中所述多个核酸分子彼此具有序列同一性；(b)在足以将第一多个核苷酸掺入与所述多个核酸分子的第一子集偶联的第一多个生长链中的条件下，使所述多个核酸分子与包含相同规范碱基类型的所述第一多个核苷酸的第一反应混合物接触；以及(c)在(b)之后，在足以将第二多个核苷酸掺入与所述多个核酸分子的第二子集偶联的第二多个生长链中的条件下，使所述多个核酸分子与包含所述相同规范碱基类型的所述第二多个核苷酸的第二反应混合物接触，其中所述第一多个核苷酸或所述第二多个核苷酸包含非终止核苷酸。2.如权利要求1所述的方法，其中在第一组反应条件下使所述第一反应混合物与(b)中的所述多个核酸分子接触，并且其中在与所述第一组反应条件不同的第二组反应条件下使所述第二反应混合物与(c)中的所述多个核酸分子接触。3.如权利要求2所述的方法，其中所述第一组反应条件和所述第二组反应条件具有一个或多个不同的条件，所述条件选自温度、pH值、盐浓度、镁浓度、锰浓度、锶浓度、核苷酸浓度、孵育时间、反应混合物体积、反应混合物到所述多个核酸分子的分配速度以及聚集或粘度试剂浓度。4.如权利要求1
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3中任一项所述的方法，其中所述第一多个核苷酸包含标记核苷酸。5.如权利要求4所述的方法，其中所述第一多个核苷酸的至少5％是标记核苷酸。6.如权利要求5所述的方法，其中所述第一多个核苷酸的至少10％是标记核苷酸。7.如权利要求6所述的方法，其中所述第一多个核苷酸的至少20％是标记核苷酸。8.如权利要求7所述的方法，其中所述第一多个核苷酸的至少30％是标记核苷酸。9.如权利要求1
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8中任一项所述的方法，其中所述第一多个核苷酸包含未标记核苷酸。10.如权利要求1
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9中任一项所述的方法，其中所述第一多个核苷酸包含标记核苷酸和未标记核苷酸。11.如权利要求1
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10中任一项所述的方法，其中所述第二多个核苷酸包含未标记核苷酸。12.如权利要求11所述的方法，其中所述第二多个核苷酸的基本上100％是未标记核苷酸。13.如权利要求1
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12中任一项所述的方法，其中所述第二多个核苷酸包含标记核苷酸。14.如权利要求1
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13中任一项所述的方法，其中所述第二多个核苷酸包含标记核苷酸和未标记核苷酸。15.如权利要求1
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14中任一项所述的方法，其中所述第一反应混合物中核苷酸的基本上100％具有所述相同规范碱基类型。16.如权利要求1
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15中任一项所述的方法，其中所述第二反应混合物中核苷酸的基本上100％具有所述相同规范碱基类型。17.如权利要求1
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16中任一项所述的方法，其中所述第一多个核苷酸是非终止的。18.如权利要求1
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17中任一项所述的方法，其中所述第二多个核苷酸是非终止的。19.如权利要求1
‑
18中任一项所述的方法，其中所述第一多个核苷酸和所述第二多个核苷酸是非终止的。
20.如权利要求1
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19中任一项所述的方法，其中将所述第一多个核苷酸的子集掺入所述第一多个生长链的生长链中，掺入所述生长链中对应于均聚物序列的核苷酸位置。21.如权利要求1
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20中任一项所述的方法，其中将所述第二多个核苷酸的子集掺入所述第二多个生长链的生长链中，掺入所述生长链中对应于均聚物序列的核苷酸位置。22.如权利要求1
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21中任一项所述的方法，其中在所述多个核酸分子中所述第一多个生长链和所述第二多个生长链是相互排斥的。23.如权利要求1
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21中任一项所述的方法，其中所述第一多个生长链和所述第二多个生长链共享至少一个共同生长链。24.如权利要求23所述的方法，其中所述至少一个共同生长链的共同生长链掺入所述第一多个核苷酸的第一核苷酸和所述第二多个核苷酸的第二核苷酸。25.如权利要求1
‑
24中任一项所述的方法，进一步包括使所述多个核酸分子与洗涤溶液接触：(i)在(b)之后且在(c)之前，(ii)在(c)之后，或(iii)(i)和(ii)两者。26.如权利要求1
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25中任一项所述的方法，其中所述第一多个核苷酸包含标记核苷酸，并且进一步包括使所述多个核酸分子与切割溶液接触以从所述标记核苷酸切割标记：(i)在(b)之后且在(c)之前，(ii)在(c)之后，或(iii)(i)和(ii)两者。27.如权利要求1
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26中任一项所述的方法，进一步包括，在(c)之后，在足以将第三多个核苷酸掺入与所述多个核酸分子的第三子集偶联的第三多个生长链中的条件下，使所述多个核酸分子与包含所述相同规范碱基类型的所述第三多个核苷酸的第三反应混合物接触。28.如权利要求1
‑
26中任一项所述的方法，进一步包括在第二流循环中，使用第三反应混合物代替所述第一反应混合物重复(b)
‑
(c)，其中所述第三反应混合物包含与所述相同规范碱基类型不同的第二相同规范碱基类型的第三多个核苷酸，并且使用第四反应混合物代替所述第二反应混合物，其中所述第四反应混合物包含所述第二相同规范碱基类型的第四多个核苷酸。29.如权利要求28所述的方法，进一步包括在第三流循环中，使用第五反应混合物代替所述第一反应混合物重复(b)
‑
(c)，其中所述第五反应混合物包含与所述相同规范碱基类型和所述第二相同规范碱基类型不同的第三相同规范碱基类型的第五多个核苷酸，并且使用第六反应混合物代替所述第二反应混合物，其中所述第六反应混合物包含所述第三相同规范碱基类型的第六多个核苷酸。30.如权利要求29所述的方法，进一步包括在第四流循环中，使用第七反应混合物代替所述第一反应混合物重复(b)
‑
(c)，其中所述第七反应混合物包含与所述相同规范碱基类型、所述第二相同规范碱基类型和所述第三相同规范碱基类型不同的第四相同规范碱基类型的第七多个核苷酸，并且使用第八反应混合物代替所述第二反应混合物，其中所述第八反应混合物包含所述第四相同规范碱基类型的第八多个核苷酸。31.如权利要求28
‑
30中任一项所述的方法，进一步包括在所述第二流循环之前使所述
多个核酸分子与洗涤溶液接触。32.如权利要求28
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31中任一项所述的方法，其中所述第一多个核苷酸包含标记核苷酸，并且进一步包括在所述第二流循环之前使所述多个核酸分子与切割溶液接触以从所述标记核苷酸切割标记。33.如权利要求1
‑
32中任一项所述的方法，进一步包括，在(b)之后或在(c)之后，检测指示所述第一多个核苷酸掺入的一个或多个信号。34.如权利要求1
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33中任一项所述的方法，其中在检测指示所述第一多个核苷酸掺入的一个或多个信号之前或不存在检测指示所述第一多个核苷酸掺入的一个或多个信号的情况下进行(c)。35.一种用于测序的方法，包括：(a)提供多个核酸分子，其中所述多个核酸分子彼此具有序列同一性；(b)在足以将所述第一多个核苷酸掺入与所述多个核酸分子的第一子集偶联的第一多个生长链中的条件下，使所述多个核酸分子与包含相同规范碱基类型的第一多个核苷酸的第一反应混合物接触；以及(c)在(b)之后，在足以将第二多个核苷酸掺入与所述多个核酸分子的第二子集偶联的第二多个生长链中的条件下，使所述多个核酸分子与包含所述相同规范碱基类型的所述第二多个核苷酸的第二反应混合物接触，其中在检测指示所述第一多个核苷酸掺入的一个或多个信号之前或不存在检测指示所述第一多个核苷酸掺入的一个或多个信号的情况下进行(c)。36.如权利要求35所述的方法，其中在第一组反应条件下使所述第一反应混合物与(b)中的所述多个核酸分子接触，并且其中在与所述第一组反应条件不同的第二组反应条件下使所述第二反应混合物与(c)中的所述多个核酸分子接触。37.如权利要求36所述的方法，其中所述第一组反应条件和所述第二组反应条件具有一个或多个不同的条件，所述条件选自温度、pH值、盐浓度、镁浓度、锰浓度、锶浓度、核苷酸浓度、孵育时间、反应混合物体积、反应混合物到所述多个核酸分子的分配速度以及聚集或粘度试剂浓度。38.如权利要求35
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37中任一项所述的方法，其中所述第一多个核苷酸包含标记核苷酸。39.如权利要求38所述的方法，其中所述第一多个核苷酸的至少5％是标记核苷酸。40.如权利要求39所述的方法，其中所述第一多个核苷酸的至少10％是标记核苷酸。41.如权利要求40所述的方法，其中所述第一多个核苷酸的至少20％是标记核苷酸。42.如权利要求41所述的方法，其中所述第一多个核苷酸的至少30％是标记核苷酸。43.如权利要求35
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42中任一项所述的方法，其中所述第一多个核苷酸包含未标记核苷酸。44.如权利要求35
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43中任一项所述的方法，其中所述第一多个核苷酸包含标记核苷酸和未标记核苷酸。45.如权利要求35
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44中任一项所述的方法，其中所述第二多个核苷酸包含未标记核苷酸。46.如权利要求45的方法，其中所述第二多个核苷酸的基本上100％是未标记核苷酸。
47.如权利要求35
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46中任一项所述的方法，其中所述第二多个核苷酸包含标记核苷酸。48.如权利要求35
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47中任一项所述的方法，其中所述第二多个核苷酸包含标记核苷酸和未标记核苷酸。49.如权利要求35
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48中任一项所述的方法，其中所述第一反应混合物中核苷酸的基本上100％具有所述相同规范碱基类型。50.如权利要求35
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49中任一项所述的方法，其中所述第二反应混合物中核苷酸的基本上100％具有所述相同规范碱基类型。51.如权利要求35
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50中任一项所述的方法，其中所述第一多个核苷酸是非终止的。52.如权利要求35
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51中任一项所述的方法，其中所述第二多个核苷酸是非终止的。53.如权利要求35
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52中任一项所述的方法，其中所述第一多个核苷酸和所述第二多个核苷酸是非终止的。54.如权利要求35
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53中任一项所述的方法，其中将所述第一多个核苷酸的子集掺入所述第一多个生长链的生长链中，掺入所述生长链中对应于均聚物序列的核苷酸位置。55.如权利要求35
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54中任一项所述的方法，其中将所述第二多个核苷酸的子集掺入所述第二多个生长链的生长链中，掺入所述生长链中对应于均聚物序列的核苷酸位置。56.如权利要求35
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55中任一项所述的方法，其中在所述多个核酸分子中所述第一多个生长链和所述第二多个生长链是相互排斥的。57.如权利要求35
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55中任一项所述的方法，其中所述第一多个生长链和所述第二多个生长链共享至少一个共同生长链。58.如权利要求57所述的方法，其中所述至少一个共同生长链的共同生长链掺入所述第一多个核苷酸的第一核苷酸和所述第二多个核苷酸的第二核苷酸。59.如权利要求35
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58中任一项所述的方法，进一步包括使所述多个核酸分子与洗涤溶液接触：(i)在(b)之后且在(c)之前，(ii)在(c)之后，或(iii)(i)和(ii)两者。60.如权利要求35
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59中任一项所述的方法，其中所述第一多个核苷酸包含标记核苷酸，并且进一步包括使所述多个核酸分子与切割溶液接触以从所述标记核苷酸切割标记：(i)在(b)之后且在(c)之前，(ii)在(c)之后，或(iii)(i)和(ii)两者。61.如权利要求35
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60中任一项所述的方法，进一步包括，在(c)之后，在足以将第三多个核苷酸掺入与所述多个核酸分子的第三子集偶联的第三多个生长链中的条件下，使所述多个核酸分子与包含所述相同规范碱基类型的所述第三多个核苷酸的第三反应混合物接触。62.如权利要求35
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61中任一项所述的方法，进一步包括在第二流循环中，使用第三反应混合物代替所述第一反应混合物重复(b)
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(c)，其中所述第三反应混合物包含与所述相同规范碱基类型不同的第二相同规范碱基类型的第三多个核苷酸，并且使用第四反应混合
物代替所述第二反应混合物，其中所述第四反应混合物包含所述第二相同规范碱基类型的第四多个核苷酸。63.如权利要求62所述的方法，进一步包括在第三流循环中，使用第五反应混合物代替所述第一反应混合物重复(b)
‑
(c)，其中所述第五反应混合物包含与所述相同规范碱基类型和所述第二相同规范碱基类型不同的第三相同规范碱基类型的第五多个核苷酸，并且使用第六反应混合物代替所述第二反应混合物，其中所述第六反应混合物包含所述第三相同规范碱基类型的第六多个核苷酸。64.如权利要求63的方法，进一步包括在第四流循环中，使用第七反应混合物代替所述第一反应混合物重复(b)
‑
(c)，其中所述第七反应混合物包含与所述相同规范碱基类型、所述第二相同规范碱基类型和所述第三相同规范碱基类型不同的第四相同规范碱基类型的第七多个核苷酸，并且使用第八反应混合物代替所述第二反应混合物，其中所述第八反应混合物包含所述第四相同规范碱基类型的第八多个核苷酸。65.如权利要求62
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64中任一项所述的方法，进一步包括在所述第二流循环之前使所述多个核酸分子与洗涤溶液接触。66.如权利要求62
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65中任一项所述的方法，其中所述第一多个核苷酸包含标记核苷酸，并且进一步包括在所述第二流循环之前使所述多个核酸分子与切割溶液接触以从所述标记核苷酸切割标记。67.如权利要求35
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66中任一项所述的方法，进一步包括，在(c)之后，检测指示所述第一多个核苷酸或所述第二多个核苷酸掺入的一个或多个信号。68.一种用于测序的方法，包括：(a)提供固定到检测区的多个核酸分子，其中所述多个核酸分子与包含模板序列的模板核酸分子具有序列同源性，其中所述多个核酸分子包含与第一序列偶联的所述多个核酸分子的第一子集和与第二序列偶联的所述多个核酸分子的第二子集；(b)在足以将第一多个核苷酸的第一核苷酸在跨所述多个核酸分子的所述第一子集的所述模板序列的给定开放位置掺入所述第一序列中的条件下，使所述多个核酸分子与包含相同规范碱基类型的所述第一多个核苷酸的第一反应混合物接触；以及(c)在(b)之后，在足以将来自第二多个核苷酸的第二核苷酸在跨所述多个核酸分子...

【专利技术属性】
技术研发人员：弗洛里安，
申请(专利权)人：阿尔缇玛基因组学公司，
类型：发明
国别省市：