【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】包括可切割或可切除部分的核酸分子
[0001]相关申请的交叉引用
[0002]本申请要求于2020年2月10日提交的国际专利申请第PCT/US2020/017491号和于2020年11月5日提交的国际专利申请第PCT/IB2020/060420号以及于2020年2月2日提交的美国临时专利申请第62/969,100号的优先权权益，所述专利申请的内容全部以全文引用的方式并入本文。
[0003]本专利技术属于核酸处理领域。
技术介绍
[0004]随着对患者特异性治疗形式的关注日益增长以及在基因组水平下的研究不断前进，正在高度寻求针对大应用和小应用两者的对整个基因组进行快速、准确且廉价测序的能力。然而，仍然存在必须攻克的技术难题。通常对具有单链DNA克隆群体的珠进行测序；然而，由于人基因组中存在大量重复序列，这些单链分子经常交叉杂交，从而导致珠结块、材料掉落以及全基因组覆盖缺失。此外，单链分子自身内在折叠，从而产生可能阻碍测序进展并在碱基识别中产生上下文偏差两者的二级结构。因此，非常期望从双链克隆群体进行测序并且实际上用双链分子执行所有制备和处理步骤的能力。
技术实现思路
[0005]本专利技术提供了包括与固体支持物连接并且包含可切割碱基的双链核酸分子的组合物。提供了分离和/或富集包括双链核酸分子的复合物的方法，所述方法包括切除所述分子内的可切割碱基，作为克隆扩增之前的预富集步骤或克隆扩增之后的后富集步骤。还提供了测序双链核酸分子的方法，所述方法包括切除所述分子内的可切割碱基与本文所描述的富集...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种分析核酸分子的方法，所述方法包括：a)提供所述核酸分子，其中所述核酸分子包括：(i)第一链，所述第一链包括至少两个可切割或可切除部分；以及(ii)第二链，并且其中所述核酸分子与支持物偶联；b)使与所述支持物偶联的所述核酸分子经受足以切割或切除所述至少两个可切割或可切除部分中的一个或多个的条件，由此产生与所述支持物偶联的经切割的核酸分子，其中所述经切割的核酸分子包括缺口或空位区；c)使所述经切割的核酸分子接触聚合酶和标记的核苷酸，其中所述标记的核苷酸被配置成发出信号；d)使所述经切割的核酸分子经受足以将所述标记的核苷酸并入到所述经切割的核酸分子的所述缺口或空位区中或并入到与所述第二链互补的新合成的链中的条件；以及e)从所述经切割的核酸分子中检测信号或信号变化，其中所述信号或所述信号变化指示所述标记的核苷酸并入到所述经切割的核酸分子的所述缺口或空位区中或并入到与所述第二链互补的所述新合成的链中；由此分析所述核酸分子。2.根据权利要求1所述的方法，其中(b)包括使所述核酸分子接触切割剂，所述切割剂被配置成切割或切除所述至少两个可切割或可切除部分中的所述一个或多个。3.根据权利要求2所述的方法，其中所述切割剂选自由以下组成的组：尿嘧啶DNA糖苷酶(UDG)、无嘧啶/无嘌呤核酸内切酶(APE)、核酸内切酶(例如，核酸内切酶VIII(EndoVIII)或V(EndoV))、尿嘧啶特异性切除试剂(USER)酶、甲酰胺嘧啶DNA糖苷酶(Fpg)、8
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氧代鸟嘌呤糖苷酶(OGG1)、RNA酶(例如，RNA酶H，如RNA酶HII)、紫外线以及其组合。4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述至少两个可切割或可切除部分独立地选自由以下组成的组：核糖核酸(RNA)碱基、尿嘧啶碱基、肌苷碱基、2,6
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二氨基
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羟基
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甲酰胺嘧啶(FapyG)碱基、8
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氧代
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二氢鸟嘌呤(8oxoG)碱基和光可切割碱基。5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述至少两个可切割或可切除部分中的两个或更多个属于不同类型。6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述缺口或空位区包括在所述核酸分子的所述第一链中的占两个或更多个碱基的空位区。7.根据权利要求1至6所述的方法，其中所述缺口或空位区包括靶核酸序列或其互补序列。8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中所述缺口或空位区与靶核酸序列或其互补核酸序列相邻。9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中所述标记的核苷酸未被封端。10.根据权利要求1至9中任一项所述的方法，其中所述标记的核苷酸包括荧光染料。11.根据权利要求1至10中任一项所述的方法，其中所述缺口或空位区包括能够通过所述聚合酶引发聚合反应的游离3'末端。12.根据权利要求1至11中任一项所述的方法，其中(c)包括使所述经切割的核酸分子接触包括包含所述标记的核苷酸的多个核苷酸的溶液，其中所述多个核苷酸中的每个核苷酸属于同一类型。13.根据权利要求12所述的方法，其中所述多个核苷酸中的每个核苷酸是标记的核苷
酸。14.根据权利要求12或13所述的方法，其中所述多个核苷酸中的额外的核苷酸并入到所述缺口或空位区中或并入到与所述第二链互补的所述新合成的链中。15.根据权利要求1至14中任一项所述的方法，其中所述核酸分子包括脱氧核糖核酸(DNA)。16.根据权利要求1至15中任一项所述的方法，其中所述核酸分子包括核糖核酸(RNA)。17.根据权利要求1至16中任一项所述的方法，其中所述支持物是颗粒。18.根据权利要求17所述的方法，其中所述颗粒固定到表面。19.根据权利要求1至18中任一项所述的方法，其中在(b)之前，所述核酸分子进一步包括捕获实体或与所述捕获实体偶联。20.根据权利要求19所述的方法，其中所述捕获实体包括选自由以下组成的组的一个或多个成员：生物素、亲和素、核酸序列、带电颗粒和磁性颗粒。21.根据权利要求19或20所述的方法，其中所述捕获实体被配置成与捕获性实体偶联。22.根据权利要求21所述的方法，其中所述捕获性实体包括选自由以下组成的组的一个或多个成员：生物素、亲和素、核酸序列、电场系统和磁场系统。23.根据权利要求21或22所述的方法，其中所述捕获实体与所述捕获性实体偶联。24.根据权利要求23所述的方法，其中所述捕获性实体与额外的支持物偶联。25.根据权利要求24所述的方法，其中所述额外的支持物是颗粒。26.根据权利要求24或25所述的方法，其中所述捕获实体靠近所述核酸分子的游离末端，并且其中至少一个可切割或可切除部分靠近所述捕获实体，使得所述可切割或可切除部分的切除使所述捕获实体与所述核酸分子解离。27.根据权利要求26所述的方法，其中(b)中的所述经受使所述核酸分子从所述额外的支持物上解脱偶联，或者其中所述方法进一步包括在步骤(b)之前使与所述支持物偶联的所述核酸分子经受足以切割或切除靠近所述捕获实体的所述至少一个可切割或可切除部分的条件。28.根据权利要求1至27中任一项所述的方法，其中所述聚合酶是链置换聚合酶。29.根据权利要求1至28中任一项所述的方法，其中在(c)之前，所述核酸分子位于分区内。30.根据权利要求29所述的方法，其中在(b)之前，所述核酸分子位于所述分区内并且在所述分区内执行步骤(b)。31.根据权利要求29或20所述的方法，其中在所述分区外执行(c)。32.根据权利要求29至31中任一项所述的方法，其中所述分区是乳液中的液滴。33.根据权利要求29至31中任一项所述的方法，其中所述分区是孔。34.根据权利要求1至33中任一项所述的方法，其进一步包括用额外的核苷酸重复(c)和(d)，其中所述标记的核苷酸和所述额外的核苷酸属于不同类型，任选地其中不同类型是不同的典型核苷碱基。35.根据权利要求34所述的方法，其中(d)中使所述经切割的核酸分子经受足以并入所述额外的核苷酸的条件包括使所述第一链的一部分与所述第二链的一部分分离。36.根据权利要求34或35所述的方法，其中所述额外的核苷酸是标记的核苷酸。
37.根据权利要求36所述的方法，其进一步包括重复(e)。38.根据权利要求1至27中任一项所述的方法，其中所述方法是分析多个核酸分子的方法，并且其中所述多个核酸分子与所述支持物偶联。39.根据权利要求38所述的方法，其中所述多个核酸分子包括共同的核酸序列。40.根据权利要求39所述的方法，其中所述共同的核酸序列是靶核酸序列。41.根据权利要求39或40所述的方法，其中所述多个核酸分子包括核酸分子的克隆群体。42.根据权利要求1至41中任一项所述的方法，其中所述方法是双端分析方法，所述第二链包括至少一个额外的可切割或可切除部分，并且在步骤(e)之后，所述方法包括：f)使与所述支持物偶联的所述经切割的核酸分子经受足以切割或切除所述至少一个额外的可切割或可切除部分中的一个或多个的条件，由此产生与所述支持物偶联的两次切割的核酸分子，其中所述两次切割的核酸分子包括所述第二链中的缺口或空位区；g)使所述两次切割的核酸分子接触聚合酶和标记的核苷酸，其中所述标记的核苷酸被配置成发出信号；h)使所述经切割的核酸分子经受足以将所述标记的核苷酸并入到所述两次切割的核酸分子的所述第二链中的所述缺口或空位区中或并入到与所述第一链互补的新合成的链中的条件；以及i)从所述两次切割的核酸分子中检测信号或信号变化，其中所述信号或所述信号变化指示所述标记的核苷酸并入到所述两次切割的核酸分子的所述第二链中的所述缺口或空位区中或并入到与所述第一链互补的所述新合成的链中；由此对所述核酸分子进行双端分析。43.根据权利要求42所述的方法，其包括在步骤(f)之前整合额外的核苷酸，所述额外的核苷酸为不允许3'聚合的封端核苷酸。44.根据权利要求42或43所述的方法，其中所述第二链的所述额外的可切割或可切除部分通过与所述第一链的所述至少两个可切割或可切除部分不同的条件进行切割。45.根据权利要求42至44中任一项所述的方法，其中步骤(g)的所述聚合酶是链置换聚合酶。46.根据权利要求42至45中任一项所述的方法，其中所述第二链上的所述缺口或空位区包括占两个或更多个碱基的空位区。47.根据权利要求42至46中任一项所述的方法，其中所述第二链上的所述缺口或空位区与第二靶核酸序列或其互补序列相邻。48.根据权利要求1至47中任一项所述的方法，其中所述第二链与所述支持物直接偶联，并且所述第一链不与所述支持物直接偶联。49.根据权利要求42至48中任一项所述的方法，其进一步包括用额外的核苷酸重复(g)和(h)，其中所述标记的核苷酸和所述额外的核苷酸属于不同类型，任选地其中不同类型是不同的典型核苷碱基。50.根据权利要求49所述的方法，其中所述额外的核苷酸是标记的核苷酸。51.根据权利要求50所述的方法，其进一步包括重复(e)。52.一种分析核酸分子的方法，所述方法包括：
a)提供所述核酸分子，其中所述核酸分子包括：(i)第一链，所述第一链包括至少一个第一可切割或可切除部分；以及(ii)第二链，所述第二链包括至少一个第二可切割或可切除部分，并且其中所述核酸分子与支持物偶联；b)使与所述支持物偶联的所述核酸分子经受足以切割或切除所述至少一个第一可切割或可切除部分的条件，由此产生与所述支持物偶联的经切割的核酸分子，其中所述经切割的核酸分子包括所述第一链中的缺口或空位区；c)使所述经切割的核酸分子接触聚合酶和标记的核苷酸，其中所述标记的核苷酸被配置成发出信号；d)使所述经切割的核酸分子经受足以将所述标记的核苷酸并入到所述第一链中的所述缺口或空位区中或并入到与所述第二链互补的新合成的链中的条件；e)从所述经切割的核酸分子中检测信号或信号变化，其中所述信号或所述信号变化指示所述标记的核苷酸并入到所述第一链中的所述缺口或空位区中或并入到与所述第二链互补的所述新合成的链中；f)使与所述支持物偶联的所述核酸分子或所述经切割的核酸分子经受足以切割或切除所述至少一个第二可切割或可切除部分的条件，由此产生与所述支持物偶联的两次切割的核酸分子，其中所述两次切割的核酸分子包括所述第二链中的缺口或空位区；g)使所述两次切割的核酸分子接触聚合酶和标记的核苷酸，其中所述标记的核苷酸被配置成发出信号；h)使所述两次切割的核酸分子经受足以将所述标记的核苷酸并入到所述第二链中的所述缺口或空位区中或并入到与所述第一链互补的新合成的链中的条件；以及i)从所述两次切割的核酸分子中检测信号或信号变化，其中所述信号或所述信号变化指示所述标记的核苷酸并入到所述第二链中的所述缺口或空位区中或并入到与所述第一链互补的所述新合成的链中；由此分析核酸分子。53.根据权利要求52所述的方法，其中步骤(b)和步骤(f)同时执行。54.根据权利要求53所述的方法，其中步骤(c)和步骤(g)同时执行，步骤(d)和步骤(h)同时执行，并且步骤(e)和步骤(i)同时执行。55.根据权利要求52至54中任一项所述的方法，其中(b)、(f)或两者包括使所述核酸分子接触切割剂，所述切割剂被配置成切割或切除所述至少第一可切割或可切除部分、所述至少第二可切割或可切除部分或两者。56.根据权利要求55所述的方法，其中所述切割剂选自由以下组成的组：尿嘧啶DNA糖苷酶(UDG)、无嘧啶/无嘌呤核酸内切酶(APE)、核酸内切酶(例如，核酸内切酶VIII(EndoVIII)或V(EndoV))、尿嘧啶特异性切除试剂(USER)酶、甲酰胺嘧啶DNA糖苷酶(Fpg)、8
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氧代鸟嘌呤糖苷酶(OGG1)、RNA酶(例如，RNA酶H，如RNA酶HII)、紫外线以及其组合。57.根据权利要求52至56中任一项所述的方法，其中所述至少第一可切割或可切除部分和第二可切割或可切除部分各自独立地选自由以下组成的组：核糖核酸(RNA)碱基、尿嘧啶碱基、肌苷碱基、2,6
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二氨基
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羟基
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甲酰胺嘧啶(FapyG)碱基、8
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氧代
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二氢鸟嘌呤(8oxoG)碱基和光可切割碱基。58.根据权利要求52至57中任一项所述的方法，其中所述至少一个第一可切割或可切
除部分和所述至少一个第二可切割或可切除部分属于不同类型。59.根据权利要求53至57中任一项所述的方法，其中所述至少一个第一可切割或可切除部分和所述至少一个第二可切割或可切除部分属于同一类型。60.根据权利要求52至59中任一项所述的方法，其中所述第一链、所述第二链或两者中的所述缺口或空位区包括占两个或更多个碱基的空位区。61.根据权利要求52至60中任一项所述的方法，其中所述第一链、所述第二链或两者中的所述缺口或空位区包括靶核酸序列或其互补序列。62.根据权利要求52至61中任一项所述的方法，其中所述第一链、所述第二链或两者中的所述缺口或空位区与靶核酸序列或其互补序列相邻。63.根据权利要求52至62中任一项所述的方法，其中所述标记的核苷酸未被封端。64.根据权利要求52至63中任一项所述的方法，其中所述标记的核苷酸包括荧光染料。65.根据权利要求52至64中任一项所述的方法，其中所述第一链、所述第二链或两者中的所述缺口或空位区各自包括能够通过所述聚合酶引发聚合反应的游离3'末端。66.根据权利要求52至65中任一项所述的方法，其中(c)、(g)或两者包括使所述经切割的核酸分子接触包括包含所述标记的核苷酸的多个核苷酸的溶液，其中所述多个核苷酸中的每个核苷酸属于同一类型。67.根据权利要求66所述的方法，其中所述多个核苷酸中的每个核苷酸是标记的核苷酸。68.根据权利要求66或67所述的方法，其中所述多个核苷酸中的额外的核苷酸并入到所述第一链、所述第二链或两者中的所述缺口或空位区中或并入到与所述第二链互补的所述新合成的链、与所述第一链互补的所述新合成的链或两者中。69.根据权利要求52至68中任一项所述的方法，其中所述核酸分子包括脱氧核糖核酸(DNA)。70.根据权利要求52至68中任一项所述的方法，其中所述核酸分子包括核糖核酸(RNA)。71.根据权利要求52至70中任一项所述的方法，其中所述支持物是颗粒。72.根据权利要求71所述的方法，其中所述颗粒固定到表面。73.根据权利要求52至72中任一项所述的方法，其中在(b)之前，所述核酸分子进一步包括捕获实体或与所述捕获实体偶联。74.根据权利要求73所述的方法，其中所述捕获实体包括选自由以下组成的组的一个或多个成员：生物素、亲和素、核酸序列、带电颗粒和磁性颗粒。75.根据权利要求73或74所述的方法，其中所述捕获实体被配置成与捕获性实体偶联。76.根据权利要求75所述的方法，其中所述捕获性实体包括选自由以下组成的组的一个或多个成员：生物素、亲和素、核酸序列、电场系统和磁场系统。77.根据权利要求75或76所述的方法，其中所述捕获实体与所述捕获性实体偶联。78.根据权利要求77所述的方法，其中所述捕获性实体与额外的支持物偶联。79.根据权利要求78所述的方法，其中所述额外的支持物是颗粒。80.根据权利要求78或79所述的方法，其中所述捕获实体靠近所述核酸分子的游离末端，并且其中至少一个额外的可切割或可切除部分靠近所述捕获实体，使得所述额外的可
切割或可切除部分的切除使所述捕获实体与所述核酸分子解离。81.根据权利要求80所述的方法，其中(b)中的所述经受使所述核酸分子从所述额外的支持物上解脱偶联，或者其中所述方法进一步包括在步骤(b)之前使与所述支持物偶联的所述核酸分子经受足以切割或切除靠近所述捕获实体的所述至少一个额外的可切割或可切除部分的条件。82.根据权利要求52至81中任一项所述的方法，其中所述聚合酶是链置换聚合酶。83.根据权利要求52至82中任一项所述的方法，其中在(c)之前，所述核酸分子位于分区内。84.根据权利要求83所述的方法，其中在(b)之前，所述核酸分子位于所述分区内并且在所述分区内执行步骤(b)。85.根据权利要求83或84所述的方法，其中在所述分区外执行(c)。86.根据权利要求83至85中任一项所述的方法，其中所述分区是乳液中的液滴。87.根据权利要求83至85中任一项所述的方法，其中所述分区是孔。88.根据权利要求52至87中任一项所述的方法，其进一步包括用额外的核苷酸重复(c)和(d)、(g)和(h)或两者，其中所述标记的核苷酸和所述额外的核苷酸属于不同类型，任选地其中不同类型是不同的典型核苷碱基。89.根据权利要求88所述的方法，其中(d)、(h)或两者中使所述经切割的核酸分子经受足以并入所述额外的核苷酸的条件包括使所述第一链的一部分与所述第二链的一部分分离。90.根据权利要求88或89所述的方法，其中所述额外的核苷酸是标记的核苷酸。91.根据权利要求90所述的方法，其进一步包括重复(e)、(i)或两者。92.根据权利要求52至91中任一项所述的方法，其中所述方法是分析多个核酸分子的方法，并且其中所述多个核酸分子与所述支持物偶联。93.根据权利要求92所述的方法，其中所述多个核酸分子包括共同的核酸序列。94.根据权利要求93所述的方法，其中所述共同的核酸序列包括第一靶核酸序列和第二靶核酸序列。95.根据权利要求93或94所述的方法，其中所述多个核酸分子包括核酸分子的克隆群体。96.根据权利要求52至95中任一项所述的方法，其中所述第二链与所述支持物直接偶联，并且所述第一链不与所述支持物直接偶联。97.一种分析核酸分子的方法，所述方法包括：a)提供所述核酸分子，其中所述核酸分子包括：(i)第一链；以及(ii)第二链，所述第二链包括至少一个可切割或可切除部分，并且其中所述核酸分子通过所述第二链的5'末端与支持物偶联；b)使与所述支持物偶联的所述核酸分子经受足以切割或切除所述至少一个可切割或可切除部分的条件，由此产生与所述支持物偶联的经切割的核酸分子，其中所述经切割的核酸分子包括所述第二链中的缺口或空位区；c)使所述经切割的核酸分子接触聚合酶和标记的核苷酸，其中所述标记的核苷酸被配置成发出信号；
d)使所述经切割的核酸分子经受足以将所述标记的核苷酸并入到所述第二链中的所述缺口或空位区中或并入到与所述第一链互补的新合成的链中的条件，其中所述标记的核苷酸并入到直接与所述支持物偶联的核酸聚合物中；e)从所述经切割的核酸分子中检测信号或信号变化，其中所述信号或所述信号变化指示所述标记的核苷酸并入到所述第二链中的所述缺口或空位区中或并入到与所述第一链互补的所述新合成的链中；f)用额外的核苷酸重复(c)、(d)和(e)，其中所述标记的核苷酸和所述额外的核苷酸属于不同类型；g)使所述第一链与所述第二链解离，由此产生与所述第二链偶联并且不与所述第一链偶联的所述支持物；h)使与所述第二链偶联并且不与所述第一链偶联的所述支持物接触聚合酶、标记的核苷酸和与所述第二链的3'区互补的寡核苷酸引物，其中所述标记的核苷酸被配置成发出信号；i)使与所述第二链偶联并且不与所述第一链偶联的所述支持物经受足以将所述标记的核苷酸并入到处于所述寡核苷酸引物的3'端并且与所述第二链互补的新合成的第一链中的条件；以及j)从与所述第二链和所述寡核苷酸引物偶联的所述支持物中检测信号或信号变化，其中所述信号或所述信号变化指示所述标记的核苷酸并入到与所述第二链互补的所述新合成的第一链中；由此分析核酸分子。98.根据权利要求97所述的方法，其中(b)包括使所述核酸分子接触切割剂，所述切割剂被配置成切割或切除所述至少一个可切割或可切除部分。99.根据权利要求98所述的方法，其中所述切割剂选自由以下组成的组：尿嘧啶DNA糖苷酶(UDG)、无嘧啶/无嘌呤核酸内切酶(APE)、核酸内切酶(例如，核酸内切酶VIII(EndoVIII)或V(EndoV))、尿嘧啶特异性切除试剂(USER)酶、甲酰胺嘧啶DNA糖苷酶(Fpg)、8
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氧代鸟嘌呤糖苷酶(OGG1)、RNA酶(例如，RNA酶H，如RNA酶HII)、紫外线以及其组合。100.根据权利要求97至99中任一项所述的方法，其中所述至少一个可切割或可切除部分选自由以下组成的组：核糖核酸(RNA)碱基、尿嘧啶碱基、肌苷碱基、2,6
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二氨基
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羟基
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甲酰胺嘧啶(FapyG)碱基、8
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氧代
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二氢鸟嘌呤(8oxoG)碱基和光可切割碱基。101.根据权利要求97至100中任一项所述的方法，其中所述第二链中的所述缺口或空位区包括占两个或更多个碱基的空位区。102.根据权利要求97至101中任一项所述的方法，其中所述聚合酶是链置换聚合酶。103.根据权利要求97至100中任一项所述的方法，其进一步包括在步骤(c)之前，使所述经切割的核酸分子接触核酸外切酶并且使所述经切割的核酸分子经受足以使处于所述缺口或空位区的3'端的所述第二链的至少一部分降解的条件。104.根据权利要求103所述的方法，其中所述缺口或空位区是仅占单个碱基的缺口。105.根据权利要求103或104所述的方法，其中所述聚合酶不是链置换聚合酶。106.根据权利要求103至105中任一项所述的方法，其中所述核酸外切酶是5'至3'核酸外切酶。
107.根据权利要求97至106中任一项所述的方法，其中所述缺口或空位区包括靶核酸序列或其互补序列。108.根据权利要求97至107中任一项所述的方法，其中所述第一链包括靶核酸序列或其互补序列。109.根据权利要求97至108中任一项所述的方法，其中所述缺口或空位区与靶核酸序列或其互补序列相邻。110.根据权利要求97至109中任一项所述的方法，其中所述标记的核苷酸未被封端。111.根据权利要求97至110中任一项所述的方法，其中所述标记的核苷酸包括荧光染料。112.根据权利要求97至111中任一项所述的方法，其中所述缺口或空位区包括能够通过所述聚合酶引发聚合反应的游离3'末端。113.根据权利要求97至112中任一项所述的方法，其中(c)、(h)或两者包括使所述经切割的核酸分子接触包括包含所述标记的核苷酸的多个核苷酸的溶液，其中所述多个核苷酸中的每个核苷酸属于同一类型。114.根据权利要求113所述的方法，其中所述多个核苷酸中的每个核苷酸是标记的核苷酸。115.根据权利要求113或114所述的方法，其中所述多个核苷酸中的额外的核苷酸并入到所述第二链中的所述缺口或空位区中或并入到与所述第二链互补的所述新合成的链、与所述第一链互补的所述新合成的链或两者中。116.根据权利要求97至115中任一项所述的方法，其中所述核酸分子包括脱氧核糖核酸(DNA)。117.根据权利要求97至116中任一项所述的方法，其中所述核酸分子包括核糖核酸(RNA)。118.根据权利要求97至117中任一项所述的方法，其中所述支持物是颗粒。119.根据权利要求118所述的方法，其中所述颗粒固定到表面。120.根据权利要求97至119中任一项所述的方法，其中在(b)之前，所述核酸分子进一步包括捕获实体或与所述捕获实体偶联。121.根据权利要求120所述的方法，其中所述捕获实体包括选自由以下组成的组的一个或多个成员：生物素、亲和素、核酸序列、带电颗粒和磁性颗粒。122.根据权利要求120或121所述的方法，其中所述捕获实体被配置成与捕获性实体偶联。123.根据权利要求122所述的方法，其中所述捕获性实体包括选自由以下组成的组的一个或多个成员：生物素、亲和素、核酸序列、电场系统和磁场系统。124.根据权利要求122或123所述的方法，其中所述捕获实体与所述捕获性实体偶联。125.根据权利要求124所述的方法，其中所述捕获性实体与额外的支持物偶联。126.根据权利要求125所述的方法，其中所述额外的支持物是颗粒。127.根据权利要求125或126所述的方法，其中所述捕获实体靠近所述核酸分子的游离末端，并且其中至少一个额外的可切割或可切除部分靠近所述捕获实体，使得所述额外的可切割或可切除部分的切除使所述捕获实体与所述核酸分子解离。
128.根据权利要求127所述的方法，其中(b)中的所述经受使所述核酸分子从所述额外的支持物上解脱偶联，或者其中所述方法进一步包括在步骤(b)之前使与所述支持物偶联的所述核酸分子经受足以切割或切除靠近所述捕获实体的所述至少一个额外的可切割或可切除部分的条件。129.根据权利要求97至128中任一项所述的方法，其中在(c)之前，所述核酸分子位于分区内。130.根据权利要求129所述的方法，其中在(b)之前，所述核酸分子位于所述分区内并且在所述分区内执行步骤(b)。131.根据权利要求129或130所述的方法，其中在所述分区外执行(c)。132.根据权利要求97至131中任一项所述的方法，其中所述分区是乳液中的液滴。133.根据权利要求97至131中任一项所述的方法，其中所述分区是孔。134.根据权利要求97至133中任一项所述的方法，其进一步包括用额外的核苷酸重复(h)和(i)或两者，其中所述标记的核苷酸和所述额外的核苷酸属于不同类型，任选地其中不同类型是不同的典型核苷碱基。135.根据权利要求134所述的方法，其中所述额外的核苷酸是标记的核苷酸。136.根据权利要求135所述的方法，其进一步包括重复(j)。137.根据权利要求97至136中任一项所述的方法，其中所述方法是分析多个核酸分子的方法，并且其中所述多个核酸分子与所述支持物偶联。138.根据权利要求137所述的方法，其中所述多个核酸分子包括共同的核酸序列。139.根据权利要求138所述的方法，其中所述共同的核酸序列包括第一靶核酸序列和第二靶核酸序列。140.根据权利要求138或139所述的方法，其中所述多个核酸分子包括核酸分子的克隆群体。141.一种组合物，其包含与支持物偶联的核酸分子，其中所述核酸分子包括第一链和第二链，并且其中所述第一链(i)包括至少三个可切割或可切除部分并且(ii)包括捕获实体或与所述捕获实体偶联。142.根据权利要求141所述的组合物，其中所述核酸分子的所述第二链缺乏可切割或可切除部分。143.根据权利要求141或142所述的组合物，其中所述核酸分子的所述第二链与所述支持物偶联。144.根据权利要求141至143中任一项所述的组合物，其中所述核酸分子的所述第一链与所述支持物偶联。145.根据权利要求141至144中任一项所述的组合物，其中所述至少三个可切割或可切除部分中的可切割或可切除部分选自：核糖核酸(RNA)碱基、尿嘧啶碱基、肌苷碱基、2,6
‑
二氨基
‑4‑
羟基
‑5‑
甲酰胺嘧啶(FapyG)碱基、8
‑
氧代
‑
7,8
‑
二氢鸟嘌呤(8oxoG)碱基和光可切割碱基。146.根据权利要求145所述的组合物，其中所述核酸分子包括脱氧核糖核酸(DNA)，并且所述至少三个可切割或可切除部分是RNA碱基，并且其中除了所述至少三个可切割或可切除部分之外，所述核酸分子缺乏RNA碱基。
147.根据权利要求141至146中任一项所述的组合物，其中所述核酸分子的所述第一链包括侧接有第一衔接子和第二衔接子的靶核酸序列，其中所述第一衔接子安置在所述第一链的第一末端，并且所述第二衔接子安置在所述第一链的第二末端，并且其中所述第一衔接子包括所述至少三个可切割或可切除部分。148.根据权利要求147所述的组合物，其中所述第二链包括第三衔接子和第四衔接子，所述第三衔接子包括与所述第一衔接子的序列互补的序列，所述第四衔接子包括与所述第二衔接子的序列互补的序列，其中所述第三衔接子安置在所述第二链的第一末端，并且所述第四衔接子安置在所述第二链的第二末端。149.根据权利要求148所述的组合物，其中所述第二链通过所述第四衔接子与所述支持物偶联。150.根据权利要求141至149中任一项所述的组合物，其中所述至少三个可切割或可切除部分中的第一可切割或可切除部分靠近所述核酸分子的所述第一链的末端。151.根据权利要求150所述的组合物，其中所述末端是5'末端。152.根据权利要求150所述的组合物，其中所述末端是3'...
【专利技术属性】
技术研发人员：D，
申请(专利权)人：阿尔缇玛基因组学公司，
类型：发明
国别省市：
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